１－磷酸鞘氨醇受體２（Ｓ１ＰＲ２）通過保護腸黏膜屏障功能緩解炎癥性腸病的作用

薛海波　　宋冰欣　　丁莉　　馬麗麗　　潘貽飛　　陳壇辀

[關鍵詞] 1-磷酸鞘氨醇;1-磷酸鞘氨醇受體2;腸黏膜屏障功能;炎癥性腸病

[中圖分類號] R331.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）15-0032-05

Effect of 1-phosphossphingosine receptor 2（S1PR2） on relieving inflammatory bowel disease by protecting intestinal mucosal barrier function

XUE Haibo1? ?SONG Bingxin1? ?DING Li1? ?MA Lili2? ?PAN Yifei3? ?CHEN Tanzhou1

1.Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000，China; 2.Department of Rheumatology and Immunology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000， China; 3.Department of Colorectal and Anal Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 1-phossphingosine receptor 2（S1PR2） on relieving inflammatory bowel disease （IBD） by protecting the intestinal mucosal barrier. Methods S1PR2 gene knockout mice were constructed. Dextran sulfate sodium salt （DSS） was used to induce colitis. Serum fluorescein isothiocyanate （FITC） concentration was measured for intestinal permeability of mice in vitro and in vivo. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6） and interferon-γ （IFN-γ） in cell suspensions were determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The survival rate and body weights of wild-type（WT） mice were higher than those of S1PR2-/- mice， and the differences were statistically significant（P<0.05）. The concentrations of IFN-γ， IL-6 and TNF-α in colon cell suspension of mice in the DSS group were higher than those in the control group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion? S1PR2 alleviates inflammatory bowel disease by protecting intestinal mucosal barrier function.

[Key words] 1-phosphossphingosine; 1-phosphossphingosine receptor 2 （S1PR2）; Intestinal mucosal barrier function; Inflammatory bowel disease

炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一種胃腸黏膜存在持續性炎癥反應導致胃腸結構和功能紊亂的特發性腸道炎癥性疾病，臨床表現為腹瀉、腹痛，甚至可有血便，主要包括潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn′s disease，CD）。炎癥性腸病的病因和發病機制尚未完全明確，已知腸道黏膜免疫系統異常反應所導致的炎癥反應在IBD發病中起重要作用，認為其是由多因素相互作用所致，主要包括遺傳、免疫因素、環境和微生物[1]。其治療手段有限，反復發作的特性和可能的惡變傾向給臨床醫師和患者帶來很大困擾，急需研究其發病機制，為臨床治療提供依據。

腸黏膜屏障是機體抵御外環境侵襲的重要屏障。腸黏膜屏障主要由機械屏障、生物屏障、化學屏障及免疫屏障組成。其中機械屏障最為重要，機械屏障由腸上皮細胞及其連接構成，調控著水和溶質的跨上皮運輸。腸上皮細胞間的連接方式有多種，包括緊密連接、粘附連接和縫隙連接及橋粒等[2]。腸上皮緊密連接的損傷參與了多種疾病的進展。因此，維持完整的腸上皮細胞緊密連接對保護腸屏障功能、防止細菌移位及毒性大分子進入人體有重要的意義。由細胞間連接變化引起的細胞通透性改變導致的腸黏膜屏障功能失調是IBD的發病機制中的一個關鍵因素。

1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1，S1P）是一種在生理和病理條件下參與調解多種細胞功能的活性鞘脂。S1P可以直接作為細胞內信號分子或細胞外通過激活5個G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）發揮作用[3]。過去二十年，對S1P及其受體在健康和疾病中的作用進行了大量的研究。研究已經表明S1P是多種類型的細胞增殖、遷移和存活的一個關鍵調節因子[4]。在不同的組織或器官中5種S1PRs的表達具有差異性[5]。在人腸道內，所有5種（Sphingosine-1-phosphate receptors，S1PRs）均能被檢測到，但是S1PRs表達水平不一。前期已有文獻報道，S1P通過激活S1PR1調節粘著連接蛋白E-cadherin的表達增強腸上皮細胞屏障功能[6]。同時也有文獻報道，S1P通過Akt依賴途徑防止腸上皮細胞凋亡[7]。這些研究表明，S1P及其受體能夠促進腸上皮細胞增殖和增強上皮細胞屏障功能，對腸黏膜屏障起到保護作用。S1PR2在腸上皮細胞增殖和上皮細胞屏障中的作用未見報道，而筆者的前期研究發現，S1PR2在腸上皮細胞高表達，是S1P在腸上皮細胞的主要受體，因而S1PR2對腸黏膜屏障保護作用值得研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

采用C57BL/6小鼠，8～12周，體重中位數22.5 g，雌雄不限，生活環境控溫控濕，具有12 h晝夜循環，并提供充足食水，每周換籠2次。S1PR2基因敲除小鼠[實驗動物許可證：SYXK（浙）2018-0017]如前制備[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 動物處理? 繁殖并驗證C57BL/6來源的S1PR2-/-小鼠品系。利用S1PR2-/-小鼠，并以野生型（Wild type，WT）鼠為對照。用含有2.5%的硫酸葡聚糖鈉鹽（Dextra sulfare sodium，DSS）的水喂養小鼠7 d，以誘導結腸炎。1周后更換正常不含DSS的水，繼續喂養小鼠1周，并在第14天處死。本動物實驗通過溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會。

1.2.2 小鼠一般狀況觀察? 以喂食DSS開始算起，取0、4、7和14 d小鼠結腸和血，每個時間點各取WT和KO 6只，解剖小鼠并檢測結腸長度。每天稱量小鼠體重和收取糞便，記錄小鼠體重變化和生存情況。

1.2.3 小鼠腸通透性檢測 使用異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的葡聚糖（FITC-葡聚糖，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）測量活體小鼠腸通透性。采小鼠外周血與磷酸緩沖液（Phosphatic buffer solution，PBS）溶液1∶3體積稀釋，測血清中FITC含量，進而繪制標準曲線。簡單來說，先將小鼠禁食6 h，然后給予50 mg/mL的FITC-葡聚糖灌胃處理（0.6 mg/g體重）。1 h后，經尾靜脈采血120 μL。然后按照前述方案給予小鼠DSS。14 d后，在實驗結束或處死小鼠前同樣給予50 mg/mL FITC-葡聚糖灌胃（0.6 mg/g體重），后經心臟采血120 μL。將收集到的血液離心，用PBS溶液1∶1體積稀釋血漿。使用多功能酶標儀（BioTek，Winooski，VT，USA）在激發波長485 nm和發射波長535 nm下測FITC-葡聚糖濃度。

1.2.4 結腸組織學? 10%福爾馬林固定結腸切片組織，蘇木精和伊紅染色（H&E）。顯微鏡（Olympus IX70，Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan）下觀察。

1.2.5 制備結腸組織細胞懸液? 頸椎脫位法處死小鼠，取仰臥位，打開腹腔。切取結腸測量長度，清理腸道內容物，并用含1%胎牛血清（Foetal bovine serum，FBS）和不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（Free of calcium and magnesium，CMF-HBSS）清洗腸道。將結腸切至2 mm大小，浸泡在含有3 mM[3]乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的CMF-HBSS中，置于臺式恒溫振蕩器振蕩，37℃，180 rpm/min。振蕩30 min后離心，用含1 mg/mL Ⅳ型膠原酶和DNA酶I的HBSS溶液消化沉淀1.5 h，300目網篩過濾去除雜質和未消化的組織塊后，得到小鼠結腸組織的細胞懸浮液。

1.2.6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）? 將上述得到的小鼠結腸細胞懸液離心，用PBS液洗2次，然后用含10%FBS的無血清細胞凍存培養基（Roswell park memorial institute，RPMI）1640重懸。細胞計數后，接種細胞至24孔板（每孔4×105細胞），培養24 h。ELISA試劑盒（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）測上清中腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）濃度。

1.3 統計學處理

所有實驗至少重復3次，結果以均數±標準差表示。使用GraphPad Prism5.0（GraphPad，San Diego，CA），采取單因素方差分析（One-way ANOVA）和鄧肯檢驗（Duncan′s test）分析數據。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 S1PR2-/-小鼠易感DSS誘導的結腸炎

本研究構建了S1PR2基因敲除小鼠（S1PR2-/-），以正常小鼠作為對照，比較兩者對DSS誘導的結腸炎的敏感性。給予小鼠2%DSS溶液共7 d以誘導結腸炎，最終在第14天處死小鼠。體重減輕30%可視為人道終點。圖1A顯示了小鼠結腸組織中S1PR2蛋白的表達，表明成功建立了S1PR2-/-小鼠。2%DSS處理7 d后，WT和S1PR2-/-小鼠的存活率分別為80%和40%，表明DSS處理后S1PR2-/-小鼠的存活率較低（圖1B）。此外，WT小鼠的體重總是高于S1PR 2-/-小鼠，表明S1PR2-/-小鼠的體重下降比WT小鼠更顯著（圖1C）。

將小鼠分為4組（WT組，2%DSS+WT組，S1PR2-/-組，2%DSS+S1PR2-/-組）。如圖1D，血清FITC濃度代表了小鼠腸道通透性，結果顯示DSS+小鼠的血清FITC濃度高于對照組小鼠。此外，S1PR2-/-小鼠血清FITC濃度亦高于WT小鼠，表明S1PR2-/-小鼠體內存在更嚴重的腸黏膜損害。圖1E表示，DSS處理后，小鼠結腸長度明顯縮短，且S1PR2-/-小鼠的結腸縮短比WT小鼠更明顯。接下來，檢測四組結腸組織中S1P蛋白的表達，結果顯示DSS處理的WT和S1PR2-/-小鼠中S1P蛋白表達明顯增加（圖1F）。

2.2 2%DSS+S1PR2-/-小鼠誘發更嚴重的腸炎

為研究其結腸組織病理學，用H&E染色小鼠結腸切片，并制備結腸組織細胞懸浮液。如封三圖5A所示，對照組WT和S1PR2-/-小鼠結腸上皮完整，可見杯狀細胞，未見炎性細胞浸潤。DSS處理組的WT小鼠腸黏膜變得松弛，盡管黏膜層仍完整，但可見炎性細胞浸潤。而DSS處理組的S1PR2-/-小鼠黏膜上皮可見大量炎細胞浸潤，腸屏障結構有實質性破壞，杯狀細胞消失。

制備的小鼠結腸細胞懸液用RPMI1640完全培養基培養24 h，ELISA法檢測TNF-α，IL-6和IFN-γ，結果分別如封三圖5B，封三圖5C和封三圖5D所示。DSS處理組小鼠結腸細胞懸液中IFN-γ、IL-6和TNF-α濃度較對照組水平升高，其中，2%DSS+S1PR2-/-組的細胞因子水平高于2%DSS+WT組。

3 討論

炎癥性腸病（IBD）是一組不明原因的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病。IBD發病機制目前尚不明確，普遍認為與免疫異常、遺傳易感性、腸道菌群失調以及感染、環境、心理等因素相關。近年研究表明，IBD患者均存在腸黏膜屏障受損，這可能會引起細胞因子分泌異常、腸黏膜萎縮、通透性改變及腸道菌群移位，導致炎癥的反復發作及加重。目前，臨床上治療IBD以免疫抑制劑或激素治療為主，然而這些藥物使用規范較為嚴格，不規范的用法極易產生不良反應及耐藥;對于嚴重的IBD患者，雖可采取外科治療手段，但也有出現吻合口難以愈合，需要反復手術，并有短腸綜合征、超短腸綜合征手術并發癥。

近年來研究表明通過黏膜修復或可以誘導IBD患者持續的臨床緩解，減少住院和手術次數，改善患者的生存質量[10]。腸黏膜屏障是由機械屏障、化學屏障、免疫屏障和生物屏障4個部分構成，其中任何一個屏障的損傷均會導致腸黏膜屏障被破壞，致使其功能受損，誘發腸源性感染[11-12]。腸上皮屏障完整性的破壞與多種病理狀態有關。過去20年，對S1P及其受體在健康和疾病中的作用進行了大量的研究，表明S1P是多種類型的細胞增殖、遷移和存活的一個關鍵調節因子。S1P是一種高度活躍的脂質信號分子，具有廣泛的生物活性，包括調節細胞骨架重排、血管生成和血管成熟、細胞增殖和存活、鈣穩態、免疫細胞遷移以及內皮和上皮屏障功能[13-14]。S1P的組織分布分析表明，其在腸道中的含量非常高[15]。有報道指出，S1P能夠抑制腸上皮細胞凋亡，調節粘連蛋白E-cad的表達，還可以提高腸上皮細胞屏障功能[16-17]。

小鼠急性DSS誘導結腸炎是一種在人體病理生理學領域常用的腸黏膜屏障損害模型。本實驗中，小鼠結腸組織中S1PR2蛋白低表達，表明成功構建S1PR2-/-基因敲除小鼠。DSS處理后，S1PR2-/-小鼠的存活率明顯低于WT小鼠，體重下降比WT小鼠更顯著，結腸縮短比WT小鼠更顯著。S1PR2-/-小鼠血清FITC濃度亦高于WT小鼠，說明S1PR2-/-小鼠比WT小鼠對DSS誘導的結腸炎更易感。結腸組織切片H&E染色顯示，對照組WT和S1PR2-/-小鼠結腸上皮完整，可見杯狀細胞，未見炎性細胞浸潤。DSS處理組的S1PR2-/-小鼠黏膜上皮可見大量炎細胞浸潤，腸屏障結構有實質性破壞。本文研究小鼠結腸組織來源的炎癥因子IFN-γ、IL-6和TNF-α，結果表明DSS處理組小鼠結腸細胞懸液中IFN-γ、IL-6和TNF-α濃度較對照組水平升高。這些數據表明，DSS在S1PR2-/-小鼠體內誘發了更嚴重的腸炎。大量研究表明DSS誘導的急性結腸炎與大量炎癥因子有關，如IFN-γ、IL-6和TNF-α[18]，這與本研究結果一致。有研究指出，S1P誘導的DRA表達上調是由S1PR2介導的，DRA是參與哺乳動物腸道吸收電中性鹽的主要Cl-/HCO3-交換器[19]。最近的幾項研究進一步表明，激活S1PR2可以減少活性氧的形成，抑制細胞死亡，負調控巨噬細胞活化[20]。這些研究結果說明S1PR2還能保護腸黏膜化學屏障的完整性，進一步提高腸道屏障功能。

筆者目前的研究表明，S1P介導的S1PR2激活在維持腸道屏障功能方面起著關鍵作用。S1P/S1PR介導的信號通路是否參與了與屏障功能障礙相關的胃腸道疾病的發病機制尚不清楚。了解這些信號通路將為發掘腸黏膜發育不全、短腸綜合征等胃腸道疾病的新治療方法提供重要信息。許多研究主要受限于定義不同、研究設計不同等，導致對腸黏膜修復的定義尚不十分明確，不同藥物的效應規模也無法準確估計。這均有待于制定一個標準的黏膜修復定義和進一步的研究。

綜上所述，腸道屏障功能是維持腸道穩態的關鍵。本次研究表明，S1PR2通過保護腸黏膜屏障功能緩解炎癥性腸病。筆者希望本次研究結果能為今后研究改善腸黏膜屏障功能、減輕炎癥反應、促進腸黏膜屏障修復提供新的方向和思路。

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（收稿日期：2021-01-12）