電針頭部特定區域和穴位對大腦中動脈阻塞大鼠缺血再灌注后不同時間點腦皮質長鏈非編碼RNA差異性表達的影響※

梁 超 鮑春齡 彭彩鈺 張燕珍 陳少萍 歐陽禮

(海南省海口市中醫醫院針灸科，海南 海口 570216)

近年來，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)被發現具有多種方式參與基因的調控與表達，如內源競爭吸附、染色質重塑、轉錄激活和轉錄阻遏等[1-2]，其轉錄機制在減輕缺血性卒中(CIS)損傷中發揮了重要作用，比如通過競爭性內源RNA起作用，lncRNA MEG3靶向調節miR-21/程序性細胞死亡因子4(PDCD4)信號通路影響神經元死亡[3]，lncRNA Malat1在血腦屏障中發揮抗凋亡和抗炎作用以減少缺血后腦血管實質性損傷[4]，lncRNA N1LR通過抑制p53磷酸化來增強對缺血后神經元保護作用[5]。近期有研究對CIS患者外周血轉錄組lncRNA進行統計分析，得出了其具有作為卒中標志物潛力的結論[6]，但lncRNA在CIS的作用及相關分子機制仍需進一步研究。本實驗以電針為干預手段，通過高通量測序分析比較電針對腦缺血再灌注后不同時間點腦皮質lncRNA的差異表達，并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time PCR)加以驗證，以探討lncRNA在腦缺血中的相關調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF級)SD雄性大鼠90只，體質量(200±20) g，由海南醫學院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。飼養于海南醫學院實驗動物中心，室溫20～25 ℃，濕度50%～60%，安靜且避強光，自由食水。

1.1.2 主要試劑及儀器 水合氯醛溶液(廣州市銳博生物科技有限公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗、異硫氰酸熒光素(FITC)標記熒光二抗(廣州市銳博生物科技有限公司)，抗熒光淬滅封片劑(廣州市銳博生物科技有限公司)，real-time PCR系統[7900HT型，美國Applied Biosystems(AB)公司]，分光光度計(NanoDrop-2000，Thermo Fisher Scientific)，總RNA抽提試劑盒 (TRIzol法)、cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒(均購自武漢博士德生物工程有限公司)，腦立體定位儀(89-00136型，北方光電集團有限公司)，一次性無菌針灸針(蘇州環球針灸醫療器械有限公司，規格0.30 mm×25 mm)；電針儀(G6805-A型，汕頭市醫用設備廠有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將90只大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、電針組3組，每組30只。每組再按缺血再灌注后24、48、72 h分為3個亞組，每個亞組10只。

1.2.2 模型制備 參照Longa E Z 等[7]線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。麻醉大鼠后，仰臥位固定大鼠，備皮，消毒頸部皮膚，暴露左頸總動脈(左CCA)，沿左CCA向上分離頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)，結扎、電凝ECA殘端，在左CCA近心端和遠心端各置一動脈夾，將ECA殘端輕拉向下，插入線栓經左CCA分叉部沿ICA至大腦中動脈(MCA)；使其缺血45 min后拉出線栓使血流復灌。假手術組大鼠經麻醉切開頸部皮膚后，分離左CCA及ICA至翼腭動脈，不插線栓。縫合切口后，在切口上進行碘酒消毒并涂灑青霉素粉抗感染治療1周。室溫下禁食給水喂養，蘇醒后進行神經功能障礙評分(NSS)[7]，神經功能障礙1級以上的大鼠才能保留下來，為造模成功。其中造模失敗15只，造模后死亡7只(后續實驗中補充)。

1.2.3 治療方法 電針組3個亞組大鼠分別于缺血再灌注后相應時間點予電針頭部特定區域和穴位[8]治療。第1組：百會(頂骨正中點) 至曲鬢 (耳緣直上與耳尖水平線的交點) 連線；第2組：第1組穴位連線向前顱方向平移 0.1 寸。方法：使用一次性無菌針灸針，百會透刺曲鬢，第2組透刺方向與第1組相同，平刺0.5～0.8寸，快速捻轉1～2 min，每分鐘120轉。連接 G6805-A電針儀，第1組接正極，第2組接負極，疏密波，頻率2 Hz/100 Hz，強度1 mA，每次持續刺激30 min，每日1次，7 d為1個療程，治療3個療程，并于取材前1 h進行最后1次電針治療。模型組和假手術組大鼠造模后正常喂養，不做任何處理。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 NSS評分 參照Longa E Z 等[7]5級神經功能評分標準進行評估，評分越低說明大鼠神經功能損傷越輕。模型組及假手術組3個亞組大鼠分別于各組相對應時間點進行評估，電針組3個亞組大鼠分別于各組治療結束后評估。

1.3.2 二代高通量測序檢測MCAO大鼠腦皮質lncRNAs的表達譜 ①標本與取材。模型組及假手術組3個亞組大鼠分別于各組相對應時間點取材，電針組3個亞組大鼠分別于各組治療結束后取材。所有大鼠以10%水合氯醛足量麻醉，斷頭取腦，迅速在冰盤上剝離腦膜，除去嗅球、延髓和小腦，分離大腦皮層，仔細切取缺血灶區域大腦皮層組織塊約1 mm×1 mm×1 mm，置于冰箱-80 ℃凍存。②總RNA提取及質檢。取適量腦組織，使用TRIzol試劑進行液氮勻漿，根據標準說明書提取總RNA；對一定量的總RNA逆轉錄獲得cDNA模板，根據逆轉錄酶說明書進行操作，通過分光光度計電泳后備用。③文庫的構建與上機測序。將總RNA按照微量RNA提取試劑盒提純，利用TruSeqRNA樣品提取指南對總RNA進行分離、片段、cDNA再合成、末端片段修復等，完成測序樣本的文庫建立。采用Illumina平臺測序，選用paired-end程序進行大片段末端2×100 nt多通道檢測，整個過程由Illumina提供的數據收集軟件調控，并進行實時分析。④測序結果分析。應用生物芯片上海國家工程研究中心提供的fastx-toolkit(0.0.13)軟件去除儀器熒光系統產生誤差造成準確度不高、長度<20 nt及總體質量偏低的測序片段，應用tophat軟件(2.0.4)將經fastx-toolkit預處理后的基因組進行匹配，應用cufflink軟件對tophat 匹配的結果進行生物信息學分析，對表達差異lncRNA進行定量，參數設置為|Log2(Foldchang)|>1，P<0.05，篩選尋找差異表達的lncRNA。

1.3.2.2 real time-PCR 隨機驗證lncRNAs的表達譜 ①總RNA提取。取腦組織，按照總RNA抽提試劑盒說明書中的方法提取總RNA 1 μg，加入1 mL TRIzol Reagent，進行勻漿、離心備用。②cDNA合成。按照cDNA合成試劑盒說明書，將處理后的總RNA經焦炭酸乙二酯(DEPC)在20 μL逆轉錄反應體系中，以RNA 1 μL為模版將mRNA逆轉錄為cDNA。③real-time PCR反應。real time-PCR反應體系按照SG PCR Master Mix(2×)10 μL，Forward/Reverse primer(5 μM)0.4 μL，cDNA 1 μL和ddH2O 8.2 μL進行配置。反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 31 s，40個循環；溶解程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，和95 ℃，15 s。內參為3-磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)，引物設計由深圳銳博生物科技有限公司合成，引物序列見表1。通過各樣本中目的基因的Ct(cycle threshold)值，以模型組的△Ct值作為校正，2-△△Ct公式計算出各lncRNAs轉錄水平。

表1 引物序列

1.3.3 real-time PCR檢測MCAO大鼠腦皮質lncRNA SOCS2-AS1表達變化 ①總RAN提取。腦組織取材后，按照總RNA抽提試劑盒說明書中的方法提取總RNA，加入TRIzol Reagent 1 mL，進行勻漿、離心備用。②cNDA合成。在20 μL逆轉錄反應體系中，以RNA 1 μL為模版將mRNA逆轉錄為cDNA。③real-time PCR反應。real time-PCR反應體系按照SG PCR Master Mix(2×)10 μL，Forward/Reverse primer(5 μM)0.4 μL，cDNA 1 μL和ddH2O 8.2 μL進行配置。反應程序：95 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s→58 ℃ 20 s→72 ℃ 20 s，40個循環，末段延伸72 ℃ 5 min，溶解程序72 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃。引物序列設計由深圳銳博生物科技有限公司合成，內參為GADPH，SOCS2-AS1引物序列見表1。通過各樣本中SOCS2-AS1的Ct值，以模型組的△Ct值作為校正，2-△△Ct公式計算出各樣本中lncRNAs SOCS2-AS1的轉錄水平。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時間點NSS評分比較 見表2。

表2 各組大鼠不同時間點NSS評分比較 分，

由表2可見，模型組大鼠缺血再灌注24、48、72 h NSS評分均高于假手術組同一時間點(P<0.05)；電針組大鼠缺血再灌注24、48、72 h NSS評分均低于模型組同一時間點(P<0.05)，其中缺血再灌注48 h比較差異最顯著(P<0.01)。

2.2 MCAO大鼠腦皮質lncRNA的表達譜變化 將模型組大鼠缺血再灌注48 h數據與電針組大鼠缺血再灌注48 h數據進行差異基因篩選。結果顯示，24 530個基因，其中包括2 532個差異基因，上調表達有953個，下調表達有1 579個。lncRNA-seq鑒定基因火山圖見圖1。

注：紅色為上調表達，綠色為下調表達

2.3 MCAO大鼠腦皮質lncRNAs差異性表達比較

2.3.1 分層聚類分析 根據表達水平不同，將模型組大鼠缺血再灌注48 h與電針組大鼠缺血再灌注48 h腦皮質lncRNAs進行分層聚類分析。結果顯示，電針組的lncRNA SOCS2-AS1顯著上調，同時發現lncRNASOCS2下調。lncRNA-seq鑒定到的部分差異基因見圖2。

注：紅色為上調表達，藍色為下調表達；Treated-MCAO為電針組，Control-MCAO為模型組

2.3.2 real-time PCR驗證電針后部分差異lncRNAs相對表達量結果 電針組大鼠缺血再灌注48 h缺血腦皮質lncRNA SOCS2-AS1、lncRNA LINCOO398、lncRNA SNHG14、lncRNA LINCOO487的表達分別上調5.96±1.07倍、3.73±1.10倍、2.05±1.97倍、2.71±1.75倍(P<.05)；lncRNA SOCS2、lncRNA RP11225N的表達分別下調0.58±0.45倍、0.83±1.85倍 (P<0.05)，與高通量測序結果趨勢一致。見圖3。

圖3 電針后部分差異lncRNAs相對表達量

2.4 各組大鼠腦皮質lncRNA SOCS2-AS1表達比較 見表3。

表3 各組大鼠腦皮質lncRNA SOCS2-AS1表達比較

由表3可見，模型組大鼠缺血再灌注24、48、72 h腦皮質lncRNA SOCS2-AS1表達均高于假手術組同一時間點(P<0.05)； 電針組大鼠缺血再灌注24、48 h腦皮質lncRNA SOCS2-AS1表達均高于模型組同一時間點(P<0.05)，其中缺血再灌注72 h比較差異最顯著(P<0.01)。

3 討論

CIS屬中醫學中風范疇，病位在腦之絡脈，多由于血瘀、痰濁長期瘀滯導致氣郁或氣虛，腦之絡脈不通，又因氣虛貫穿全過程，因此激發陽氣、通調經絡氣血、祛瘀生新為主要治法。腦為元神之府，是十四經脈循行交會、經氣匯聚之處；頭為諸陽之會，“病變在腦，首選督脈”[9-10]。本研究通過電針作用于頭部“頂顳前斜線”“頂顳后斜線”，起到一經帶多經、一穴帶多穴的整合作用，同時橫跨督脈、足太陽膀胱經、足少陽膽經3條經脈，全面調整臟腑氣血，通其頭部經脈，調達全身血氣，以達到活血通絡、祛瘀生新目的。

電針能治療中樞性肢體癱瘓和感覺障礙，改善吞咽和言語功能，減輕卒中后神經行為學障礙，對缺血性腦損傷療效的確切性已被臨床證實[11-12]。我們前期聚焦腦缺血后微血管單元，發現電針頭部特定區域和穴位不僅能改善腦電活動，縮小梗死體積，減輕炎性反應，抑制神經元凋亡，還能促進血管新生[13-14]。而本研究發現電針頭部特定區域和穴位后多種lncRNA存在差異性轉錄，比較篩選出24530個基因，其中包括2532個差異基因，上調表達有953個，下調表達有1579個。提示lncRNA可能在電針治療CIS發揮重要功能。

CIS的病因學研究表明，該病的發生發展與動脈粥樣硬化、動脈斑塊積聚、血栓形成等相關，病變主要在腦部血管。因此，CIS后缺血局部和半暗帶區的神經元壞死與凋亡、血管新生及神經修復情況將嚴重影響該病的預后。lncRNA是一種參與調節細胞分化、增殖和凋亡等生理病理過程的非編碼RNA，越來越多的研究發現一系列lncRNAs表達與腦缺血有顯著關聯[15]。有研究通過UCSC數據庫hg38分析成熟的SOCS2-AS1長度約3.3 kb，位于染色體12q22，而染色體12q22編碼基因往往與血管生成相關[16]。由于細胞質中lncRNA SOCS2/miR-217/p38存在內源競爭性吸附抑制，SOCS2-AS1易于結合磷酸化p38并影響其與磷酸化的信號傳導及轉錄激活因子-5(p-STAT5)相互作用[17]。lncRNA TGF-β2與多種miRRNAs結合靶向調控自噬—炎癥反應關鍵蛋白，從而干預平衡內皮細胞的自噬和凋亡[18]。前期研究揭示，電針抑制MicroRNA-210表達干預VEGF/EPO/JAK2-S TAT5通路，可以促建新的神經血管單元以減輕腦損傷[19]，這就提示lncRNA可能與microRNA共同作用于內皮細胞，并對內皮細胞產生保護作用，減少內皮細胞的凋亡和促進血管重構再通[20]。另外，lncRNA也能通過直接影響神經元，干預其增殖和凋亡進程，影響神經功能恢復。比如lncRNA N1LR可抑制p53蛋白Serl5磷酸化，抑制p53蛋白的激活，縮小梗死面積，降低神經損傷評分值，從而發揮神經保護功能。腦缺血后部分內源性神經干細胞(neural progenitor cell，NPC)發生遷移并逐漸分化出神經元，30多種lncRNA在成熟神經元中高表達，其中lncRNA N1就參與NPC這一分化過程，lncRNA N2可以間接介導神經細胞的發生[21]。lncRNA SOCS2-AS1是電針刺激MACO大鼠后腦皮質轉錄組測序發現顯著升高表達的基因，最開始由Ota T于2004年鑒定得出[22]；SOCS2-AS1還可促使腫瘤壞死因子家族下調以干預細胞生長與增殖[23]，提示SOCS2-AS1是具有細胞調控功能的RNA。因此，腦缺血再灌注啟動后通過檢測lncRNA SOCS2-AS1的表達，能更加明確其具有促進腦缺血后神經恢復的作用。本研究中隨著缺血再灌注時間的變化，電針組大鼠缺血局部腦皮質中lncRNA SOCS2-AS1轉錄水平逐漸升高，但NSS評分卻有所下降，說明該基因表達水平的升高可減輕神經損傷的程度，這與電針刺激以改變相關lncRNA轉錄來減輕腦缺血組織損傷的觀點一致[24]。

因此，電針頭部特定區域和穴位可使MCAO大鼠的神經功能損傷得到改善，說明該治療促進了大鼠腦缺血后受損神經功能的恢復。進一步發現腦缺血再灌注后lncRNAs基因轉錄水平的變化不同，電針頭部特定區域可以增加lncRNA SOCS2-AS1的表達，這一作用可能是該療法防治CIS可能的潛在作用機制之一。