基于網絡藥理學研究青風藤治療高尿酸血癥作用機制※

高忠林 權浩浩 張曉鳳 程小紅

(陜西中醫藥大學2019級碩士研究生，陜西 咸陽 712000)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是一種常見的生化異常，由尿酸鹽生成過多或(和)腎臟尿酸排泄減少，或者兩者共同存在而引起的[1]。根據其發病機制的差異分為原發性HUA和繼發性HUA，原發性HUA多由基因突變引起，屬遺傳病；繼發性HUA常由腎臟病、藥物、血液病等引發。隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，HUA發病率呈逐年上升趨勢[2]，據統計高達21%的人群和25%的住院患者有無癥狀HUA[3]。因此，降低血清尿酸值是臨床上常用的防治HUA措施[4]。常用藥物分為促尿酸排泄藥(如丙磺舒)、抑制尿酸生成藥(如黃嘌呤氧化酶抑制劑)、堿化尿液藥(如碳酸氫鈉片)和尿酸酶合成劑(如拉布立酶)4類[5]。這4類藥物廣泛應用于臨床，其降尿酸效果顯著，療效確切[6]，得到普遍認可。但長期服用此類降尿酸藥易出現斑丘疹、脫發、胃腸道反應及腎臟毒性等副作用[7-8]。

中醫學并無HUA病名，由于無癥狀型HUA可演變為痛風，故經典文獻多將其歸為“痹證”“痛風”“白虎歷節”等范疇[9]。歷代醫家認為，HUA的發生與后天飲食不節、年老體弱、臟腑不調及先天稟賦不足有關。病機為嗜食海鮮肥甘、辛辣煎炸之品易蘊濕生熱，又逢先天體質虛弱，外感風、寒、濕、熱邪氣，致脾胃運化失司，水濕停留，郁久化熱，釀結成毒，濕熱濁毒阻塞經脈、血絡而發病[10]。王先敏等[11]通過臨床大數據分析得出，HUA主要分為水濕內停、濕熱、痰濁阻滯、血瘀、氣陰不足、脾氣虧虛、腎陽不足7個證型，其中以水濕停留、濕熱最為常見。中醫理論的“濕”相當于現代醫學概念中的“尿酸”[12]。治療上以清熱化濕、解毒化濁為主[13]。由于HUA早期僅表現為尿酸值異常升高，可無任何臨床癥狀，易忽略血清尿酸等輔助檢查。如能在無癥狀HUA期間結合患者的尿酸值辨證論治，就有可能延緩甚至遏制HUA向痛風的轉變，體現中醫“未病先防，既病防變”特色。杜敏等[14]臨床觀察證實，“治未病”理論管理HUA患者取得顯著療效，血尿酸等相關指標明顯下降，疾病得到有效控制，臨床實用價值極高，極大體現了中醫優勢。

青風藤原名清風藤，首載于宋《圖經本草》。其味苦、辛，性平，入肝、脾經，具有祛風除濕、疏通經絡、通利小便之效。Zhao Z J等[15]通過小鼠模型的體外和體內實驗發現，青風藤提取物青藤堿(Sinomenine)抗炎和滲透作用較其他化合物及衍生物強，這為青風藤綜合治療高尿酸引發炎性反應提供了基礎研究依據。此外，郝賽恒等[16]也經動物實驗證實，青風藤復方顆粒(該藥的主要成分是青風藤)具有顯著降尿酸作用。以上基礎研究提示，青風藤有良好的抗炎和降尿酸作用，但其具體作用機制尚未闡明。借助網絡藥理學預測青風藤治療HUA的作用機制具有重要的臨床意義。網絡藥理學從藥物與疾病間相互作用的系統性和整體性出發，運用計算機虛擬篩選潛在藥效成分、作用靶標及通路，構建“藥物-靶標-疾病”多維網絡聯系，初步預測出藥物作用機制[17]，符合中醫的“整體觀念”和“辨證論治”特色。因此，本研究基于網絡藥理學預測青風藤治療HUA的作用機制，結果如下。

1 資料與方法

1.1 青風藤的活性成分及作用靶標的篩選和獲得 分別于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)和中藥綜合數據庫(TCMID)數據庫輸入“青風藤”，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，查找青風藤的活性成分并查閱相關文獻進行驗證[18]。依次使用TCMSP、瑞士靶標預測數據庫(Swiss Target Prediction)和中藥分子機制的生物信息學分析工具(BATMAN-TCM)收集青風藤的作用靶標。

1.2 HUA相關基因收集 分別于療效藥靶標數據庫(TTD)、藥物數據庫(Drug Bank)、疾病相關的基因與突變位點數據庫(Dis Ge NET)和人類基因數據庫(Gene cards)以“Hyperuricemia”“Gout”為關鍵詞檢索HUA相關基因。

1.3 靶標映射 將1.1獲取的青風藤候選作用靶標和1.2收集的HUA相關基因分別導入繪圖軟件Venny 2.1中進行靶標映射。Venny 2.1用于展示在不同的事物集合之間的邏輯聯系，尤其適用于表示集合之間的關系。

1.4 生物學過程與通路富集分析 將靶標映射所獲取的基因以P<0.05為篩選條件分別借助基迪奧生物信息云平臺(Omicshare)、生物信息學資源數據庫(DAVID)進行GO和KEGG通路富集分析。DAVID是生物信息數據庫，整合生物學數據并進行分析。為大規模的基因或蛋白列表提供系統綜合的生物功能注釋信息，用于差異基因功能和通路富集分析。

1.5 成分-靶標-通路多維生物網絡的構建及分析 將篩選出的青風藤與HUA共同靶標導入Cytoscape 3.2.1軟件，構建成分-靶標-信號通路多維生物網絡。Cytoscape是一款圖形化顯示網絡并進行分析和編輯的軟件。

2 結果

2.1 青風藤活性成分 TCMSP數據庫共查到青風藤有16個活性成分，其中以OB≥30%，DL≥0.18為限定條件，共得到6個活性成分，TCMID共獲得45個作用成分。將這2個數據庫匯總去重復值并查閱相關文獻進行驗證[18]，最后篩選出26個活性成分。見表1。

表1 青風藤活性成分

2.2 青風藤作用靶標 TCMSP收集到5HT2A、ADA1A、ADA1B等360個青風藤作用靶標，Swiss Target Prediction收集到RORC、SREBF2、AR等390個作用靶標，BATMAN-TCM收集到VDR、CYP27B1、GC等301個靶標。將其匯總去重復值共得到499個靶標。

2.3 HUA相關基因的獲得 TTD得到XDH和URAT1共2個基因，Drug Bank得到ALB、FABPI、AOX等共29個基因，Dis Ge NET得到XDH、ABCG2、SLC2A9等共196個基因，Gene cards得到UMOD、SARS2、HPRT1等共625個基因，最后歸納匯總刪除重復值后共得到744個HUA相關基因。

2.4 青風藤與HUA共同靶標映射分析 將篩選出青風藤和HUA靶標進行映射共得到基因CYP27B1、MED1、BAX等58個基因。見圖1。

圖1 青風藤與HUA共同靶標映射圖

2.5 青風藤與HUA共同靶標的生物學過程與通路富集分析 借助DAVID數據庫進行GO和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析包括生物過程(biological process,BP)、細胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function，MF)3個部分，BP有positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promote、response to drug、negative regulation of cell proliferation等79個條目，CC有cytoplasm、plasma membrane、mitochondrion等26個條目，MF有protein homodimerization activity，identical protein binding，heme binding等22個相關的條目。其中涉及的BP包括腺苷酸環化酶激活多巴胺受體信號通路、調控炎癥反應、抑制細胞增殖等，CC包括細胞質、質膜、線粒體等，MF包括黃素腺嘌呤二核苷酸結合、花生四烯酸環氧酶活性、Ras鳥苷核苷酸交換因子活性等。以“Count”從大到小依次排列，取文獻和臨床報道較多的生物學過程進行可視化處理(見圖2)。KEGG通路分析對涉及的58個青風藤與HUA共同靶標的信號通路中的作用進行了篩選，得到了PI3K-Akt signaling pathway、Serotonergic synapse、Dopaminergic synapse等38條信號通路。以“Count”從大到小依次排列，取前10條通路進行可視化處理(見圖3)。

圖2 GO富集分析圖

圖3 KEGG通路分析圖

2.6 成分-靶標-通路網絡圖構建結果與分析 利用Cytoscape 3.2.1軟件，建立“青風藤—成分—基因—通路”圖(見圖4)，圖中清晰地表現了58個青風藤與HUA共同靶標分布于不同的通路，體現了青風藤對HUA的治療機制。圖中共有84個節點，131條邊。面積的大小是根據成分、靶標和通路節點和邊數目依次分布，圖中面積越大青風藤與HUA的成分靶標以及通路連線節點數目越密集，同時為保證青風藤治療HUA的作用靶標及機制預測的相對客觀、全面，結合查閱相關實驗文獻，初步預測出青風藤的作用成分可能是Sinomenine(青藤堿)，有效靶標可能是次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT1)和前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)，作用通路可能是PI3K- Akt signaling pathwa(磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶通路)和cAMP signaling pathway(環磷酸腺苷通路)。

圖4 成分-靶標-通路網絡圖

3 討論

臨床研究發現，HUA不僅可以進展為痛風，而且還可引發糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、原發性高血壓等疾病，已成為我國第二大代謝性疾病，嚴重威脅人們健康[19]。青風藤治療HUA療效確切[16]，但具體機制尚不明確。本研究借助網絡藥理學手段，獲取其治療HUA主要成分及相關的疾病基因，然后進行GO和KEGG富集分析預測青風藤治療HUA的作用機制。

本研究通過Cytoscape 3.2.1軟件共篩選出Sinomenine、beta-sitosterol、syringaresinol、Michelenolide等13個青風藤主要成分。Cabau G等[20]臨床研究證實，HUA與多種常見的成人炎性疾病有關。Wang Lan等[21]研究發現，青風藤主要成分Sinomenine、magnoflorine、menisperine和stepharanine是主要抗炎化合物，其中Sinomenine報道最多。Xu W等[22]研究證明，Sinomenine對類風濕關節炎患者外周血單核細胞增殖、細胞因子產生均有抑制作用。Zhu Q等[23]經動物實驗證實，不同劑量的Sinomenine均具有抗炎、鎮痛和抗過敏作用。Qian L等[24]也發現，Sinomenine可通過抑制小膠質細胞煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性治療炎癥介導的神經退行性疾病。因此，Sinomenine可通過抑制炎性反應而發揮治療成年人HUA的作用。

通過青風藤與HUA共同靶標進行映射得到基因CYP27B1、MED1、BAX、HPRT1和PTGS2等共58個基因，其中HPRT1和PTGS2參與了HUA的關鍵環節。HUA由尿酸產量增加或排泄減少所致[4]，Li L等[25]研究發現，HPRT可以改善內源性嘌呤的產生，進而減少尿酸的過量產生和積累。此外，HUA最常見的并發癥是痛風。Mishima E等[26]臨床研究發現，即使沒有神經系統癥狀，HPRT缺乏也是家族性青少年痛風的潛在原因。Cheng M H等[27]研究表明治療痛風的代表性藥物丙磺舒可通過抑制PTGS2(也稱COX-2)和PI3K- Akt途徑抑制活性氧(ROS)的產生并發揮抗破骨細胞活性。從上分析可得出HPRT基因部分缺乏可導致尿酸生成過量，PTGS2基因則主要參與了抑制痛風的重要環節。

GO和KEGG富集分析表明，青風藤治療HUA的通路是PI3K- Akt signaling pathway和cAMP signaling pathway。Wang C等[28]研究也證明，硫氧還蛋白(Trx)調節炎癥細胞的激活和遷移作用與cAMP-PKA通路和PI3K-Akt通路有關。Balakumar P等[29]研究發現，PI3K- Akt通路與腎性HUA密切相關。Chen C等[30]通過曲霉菌素(AST)干預骨關節炎(OA)大鼠模型發現，AST可以通過下調PI3K- Akt信號通路發揮抗炎作用，進而改善OA癥狀。Li K等[31]研究證明，羅替戈汀緩釋微球(RTGT-MS)對炎性疼痛模型大鼠的保護作用與降低cAMP、COX-2和前列腺素E2(PGE2)含量有關。以上研究顯示，PI3K- Akt通路和cAMP通路在降尿酸、抗炎和鎮痛中發揮著作用。

綜上所述，本研究初步預測青風藤治療HUA的作用機制可能是Sinomenine通過作用于HPRT1和PTGS2關鍵靶標調控PI3K-Akt和cAMP信號通路，進而發揮減少尿酸生成、抑制炎性反應和保護腎臟。在臨床和基礎研究中均未找到青風藤活性成分14-methylhexadecanoicacid Michelenolide和sinalbin治療HUA的證據，此方面研究空白可為醫學工作者提供思路。下一步將對Sinomenine的HPRT1和PTGS2基因開展基礎和臨床研究，為明確青風藤治療HUA的作用靶標和機制提供實驗證據。