結腸癌組織及血清中IL-8、VEGF和MMP-7的表達及其與腫瘤分期的相關性

藍宇萍，何圣清，陳利芬，曾蘭芳

(深圳市龍崗中心醫院體檢科，廣東 深圳 518116)

結腸癌是人類常見惡性腫瘤之一，隨著我國居民飲食結構變化，其發病率呈明顯上升趨勢，嚴重影響國民生命建康[1-2]。結腸癌臨床早期癥狀較為隱匿，患者多表現為消化不良、腹脹、腹痛等消化道癥狀，中晚期則有疼痛難忍、便血或腹腔積液等癥狀，生活質量嚴重下降，預后不佳[3]。因此，早發現、早治療對結腸癌預后，提高生存率，延長生存周期具有重要意義。結腸癌病變分為多個階段，如良性腺瘤向惡性腺癌轉變、腫瘤向遠處轉移等過程[4-5]。研究證實，在結腸癌病變、癌細胞侵襲及轉移等進展過程中，腫瘤相關的細胞因子水平變化對疾病分期診療具有重要指導意義[6-7]。有報道指出[8-9]，腫瘤組織中白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、VEGF和MMP-7等物質參與調控了腫瘤細胞免疫應答、組織血管新生、內皮細胞的增殖等過程，促進了腫瘤的生長、侵襲和轉移，導致癌變惡化，常作為腫瘤疾病的輔助診療標志物。本課題組前期研究報道[10]結腸癌患者外周血中IL-8和VEGF的變化，但癌變組織中IL-8、VEGF和MMP-7水平與結腸癌腫瘤分期有何關系尚未深入研究。我們檢測了結腸癌組織及外周血IL-8、VEGF和MMP-7水平，探索其與腫瘤分期的相關性，為結腸癌臨床診療提供一定指導。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標準

納入標準[10-11]：①經病理級內鏡檢查確診為結腸癌患者；②行結腸癌手術切除治療者。排除標準：①合并其它消化道疾病者；②合并先天性心臟病等嚴重疾病及肝、腎功能不全者；③有精神系統疾病及無法配合者。

1.2 一般資料

選取我院2013年6月至2015年6月收治的90例結腸癌患者設為觀察組，其中男49例，女41例；年齡43～69歲，平均(52.38±4.76)歲；體重52～77kg，平均(64.33±5.46)kg；根據Dukes分期分為A、B、C、D四期[8-9]，A期患者20例，B期患者32例，C期23例，D期15例。選擇同期在本院進行健康體檢的30例健康者作為對照組，其中男15例，女15例；年齡42～71歲，平均(53.82±4.51)歲；體重53～76kg，平均(66.02±5.28)kg。兩組研究對象性別比例、年齡及體重等一般資料差異無統計學意義，具有可比性(P>0.05)。本研究經過醫學倫理委員會批準，且患者及家屬簽署知情同意書后展開。

1.3 檢測觀察指標

(1)ELISA檢測外周血清IL-8、VGEF、MMP-7水平。手術前1d，空腹采集患者靜脈血(4mL)，3 000轉離心10min取上層血清，分裝后凍存于-20℃備用。采用雙抗體夾心法測定血清IL-8(購自北京邦定泰克生物技術有限公司)、VEGF(購自上海研輝生物技術有限公司)和MMP-7水平(購自上海研輝生物技術有限公司)

(2)免疫組化SP法測定腸癌組織和癌旁正常組織IL-8、VGEF、MMP-7。取患者結腸癌變組織及癌旁>5cm處正常組織進行病理組織檢測。石蠟包埋后切片(4μm)、脫蠟、酒精梯度脫洗，PBS沖洗后再抗原修復。室溫避光條件下，滴加過氧化氫溶后再血清封閉孵育20min；然后棄去血清，分別滴加IL-8、VGEF、MMP-7一抗，冰箱4℃孵育過夜；次日，PBS沖洗3次后滴加二抗孵育1h。最后，PBS再次洗滌3次，分別DAB顯色、蘇木素復染，中性樹膠封固，于恒溫顯色封片光學顯微鏡進行觀察。

(3)IL-8、VGEF、MMP-7的陽性表達評估。免疫組化染色后，細胞質中出現棕黃色顆粒即為陽性。陽性細胞數評分：<5%(0分)、5%～25%(1分)、25%～50%(2分)、50%～75%(3分)、>75%(4分)；染色強度評分：無色(0分)、淺棕黃色(1分)、棕黃色(2分)、褐棕色(3分)。根據兩者評分乘積評估：0～4分為陰性，5～12分為陽性。每張切片隨機選取10個高倍視野(200倍或400倍)，計算IL-8、VGEF、MMP-7陽性表達情況。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比較

觀察組血清IL-8、VEGF及MMP-7均顯著高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比較

2.2 不同Dukes分期結腸癌患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比較

如表2所示，結腸癌患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平隨Dukes分期加重逐漸升高。C期、D期患者的血清IL-8、VEGF及MMP-7水平顯著高于A期及B期患者，組間兩兩比較均有統計學差異(P<0.05)。見表2。

表2 不同Dukes分期結腸癌患者血清IL-8、VEGF及MMP-7水平比較

2.3 結腸癌組織IL-8、VEGF及MMP-7陽性表達結果比較

結腸癌組織IL-8、VEGF及MMP-7免疫組化結果如圖1～3(封三)所示，可見明顯棕黃色陽性表達。統計分析顯示，結腸癌組織中IL-8、VEGF及MMP-7陽性表達率分別為86.67%，92.22%及82.22%，顯著高于癌旁正常組織，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 結腸癌組織及癌旁正常組織IL-8、VEGF及MMP-7陽性表達比較

2.4 結腸癌組織IL-8、VEGF及MMP-7與Dukes分期的相關性

結腸癌A期患者中IL-8、VEGF及MMP-7陽性發表率分別為80.00%、90.00%、80.00%，B期患者分別為84.34%、87.50%、81.25%，C期患者分別為95.65%、100.00%、86.96%，D期患者分別為86.67%、93.33%、80.00%。見表4。

表4 結腸癌組織IL-8、VEGF及MMP-7與臨床Dukes分期相關性

2.5 患者結腸癌組織、血清IL-8與VEGF、MMP-7的相關性

Pearson相關性分析發現，患者血清IL-8與VEGF、MMP-7顯著正相關(r=0.880，P<0.05；r=0.774，P<0.05)；結腸癌組織中IL-8也與VEGF、MMP-7顯著正相關(r=0.622，P<0.05；r=0.473，P<0.05)。

3 討 論

隨著我國居民飲食結構變化，結腸癌發病率呈上升趨勢，嚴重威脅國民生命建康[1-2]。臨床上治療多采取腫瘤切除術，大量臨床實踐表明早發現、早治療是提高患者預后的有效方法，且結腸癌細胞的增殖、擴散和轉移是影響結腸癌治療和預后的重要因素，也是促使腫瘤患者死亡的重要原因[4-5]。因此，密切關注結腸癌腫瘤轉移一直是臨床研究的熱點。目前，臨床結直腸癌患者的預后主要通過Dukes分期進行評估，需要更簡單有效的生物標志物預測患者腫瘤轉移，實時監測腫瘤組織轉移對臨床預后判斷及指導治療有非常重要的意義。

關于腫瘤組織轉移的機制尚未明確闡述，目前多被認為是由腫瘤組織上皮細胞過度增生，同時從原發部位脫落及轉移，獲得生長所需營養物質后誘發腫瘤組織新生血管生成，進而促進腫瘤組織增殖及分化，完成腫瘤組織轉移[12-13]。該過程中腫瘤組織內新生血管的生成與腫瘤侵襲和轉移密切相關，為腫瘤的生長繁殖提供營養物質及血氧需求，兩者相輔相成加速腫瘤細胞的增殖和擴散[14]。腫瘤的生長及轉移依賴于新生腫瘤血管，為腫瘤組織生長提供所需的血氧及營養物質。IL-8作為CXC基因家族因子，廣泛存在于腫瘤組織中。本文結果顯示，結腸癌患者組織中IL-8陽性率顯著高于癌旁正常組織，且在血清IL-8也有較高表達(P<0.05)；隨著Dukes分期加重，結腸癌組織和血清中IL-8表達也逐漸上調(P<0.05)，這表明IL-8大量釋放，參與了結腸癌的發生發展。

IL-8以旁分泌方式與白細胞和血管內皮細胞表達的CXCR受體結合，促使白細胞趨化進入腫瘤組織和引起內皮細胞增殖形成新生血管，促進腫瘤組織轉移[15-16]。VEGF和MMP-7被認為與調節血管內皮細胞增殖和分裂相關，提高腫瘤生長速率及侵襲和轉移潛力，可作為判斷結腸癌惡性程度的標志物。觀察組患者結腸癌組織中VEGF及MMP-7陽性表達率較癌旁正常組織有明顯升高(P<0.05)，同時血清中VEGF及MMP-7變化和組織中具有一致性。作為促血管生成因子，VEGF可加速內皮細胞的增殖與分裂，增強毛細血管上皮細胞的通透性，促進腫瘤組織內新生血管的形成[17-18]；而MMP-7則能降解和破壞靠近腫瘤表面的細胞外基質和基膜，加速腫瘤細胞向周圍組織的浸潤[19-20]，VEGF和MMP-7協調加速了腫瘤細胞增殖及轉移能力。因此，患者結腸癌組織和血清中VEGF及MMP-7表達越高，Dukes分期就越嚴重。

隨腫瘤侵襲轉移，患者結腸癌組織及血清中IL-8表達上調的同時，VEGF、MMP-7含量也明顯增加，Pearson相關性分析顯示IL-8水平與VEGF、MMP-7含量顯著正相關(P<0.001)，IL-8可作為輔助臨床診療的重要評估指標之一。IL-8在結腸癌中通過哪一條信號通路，直接或間接激活VEGF、MMP-7上調促進腫瘤進展尚未完全明確，具體機制有待后續動物或細胞實驗證實。

綜上所述，IL-8、VEGF及MMP-7在結腸癌組織和血清中均有高表達，與腫瘤Dukes分期密切相關；同時結腸癌組織及血清中IL-8表達與VEGF及MMP-7明顯正相關，在結腸癌發生發展過程中起到重要作用。IL-8、VEGF及MMP-7可作為臨床診療及預后的重要評估指標，輔助指導臨床治療。