線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的研究進展*

周 云，王玲娥，余 薇，查文良**

(1.湖北科技學院臨床醫學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院藥學院)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種從鏈霉菌中提取出的蒽環類抗生素，被廣泛用于治療白血病、實體腫瘤、軟組織肉瘤和乳腺癌等多種癌癥[1]。然而，當機體內阿霉素的累積劑量超過其治療安全閾值時，心臟的結構和功能會受到嚴重損傷，表現為心律失常、心肌病、左室功能障礙與充血性心力衰竭等一系列病理改變，致使阿霉素在臨床應用上受到嚴重限制[2-3]。研究發現[4]，阿霉素誘導的心肌損傷涉及多種機制，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生、脂質過氧化和線粒體功能障礙等，其中線粒體功能障礙被認為是阿霉素誘導心臟毒性發生的關鍵，因此，其調控途徑可作為防治阿霉素心臟毒性的一個新的潛在靶點。

1 線粒體自噬

線粒體作為真核細胞的動力來源，主要負責調節三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)產生和細胞能量代謝的關鍵細胞器。同時也作為ROS的主要來源，其產生的ROS可氧化線粒體內外的蛋白質、脂質以及核酸，引起細胞內線粒體結構損傷和功能紊亂，最終導致細胞損傷甚至死亡。

線粒體自噬作為一種選擇性的自噬，一直被認為是負責調控線粒體質量的潛在機制，主要通過自噬體形成以及自噬體和溶酶體融合的方式選擇性清除細胞內結構損傷和功能障礙的線粒體或降解不必要的正常的線粒體，防止ROS等有害產物的積累，同時保證線粒體的正常功能，對滿足細胞能量需求和維持細胞內環境平衡具有關鍵作用。值得注意的是，功能失調的，主要是有缺陷的線粒體自噬參與各種人類疾病的病理生理進程，包括心血管疾病、神經退行性疾病、癌癥、自身免疫性疾病和衰老等[5]。因此，線粒體自噬的分子機制和功能研究備受關注。目前，研究發現線粒體自噬的分子機制與酵母中的自噬相關蛋白32以及哺乳動物細胞中的線粒體分裂和融合相關蛋白、PTEN誘導性激酶蛋白1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)、E3泛素連接酶Parkin、Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3)、Nip3樣蛋白X(NIP3-like protein X，NIX)、FUN14結構域包含蛋白1(FUN14 domain containing 1，FUNDC1)等密切相關[6-7]。例如，在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)中，磷酸酶張力蛋白同源物通過抑制線粒體自噬促進內皮細胞凋亡，同時高蛋白飲食導致過量氨基酸攝入，也會通過阻斷NIX介導的線粒體自噬活性，加劇動脈粥樣硬化斑塊的巨噬細胞凋亡和熱下垂[8]。此外，在阿霉素誘導的心臟毒性中，阿霉素誘導線粒體自噬，表現為自噬小體、輕鏈3(light chain 3，LC3)、Beclin1增加、p62減少以及LC3在線粒體中的共定位，同時阿霉素激活PINK1/Parkin通路，促進PINK1/Parkin向線粒體轉運[9]。因此，表明線粒體自噬與阿霉素誘導的心臟毒性密切相關，然而其確切的分子機制尚未完全闡明。

2 阿霉素誘導的心臟毒性中線粒體自噬的分子機制

在阿霉素誘導的心臟毒性中，阿霉素誘發的ROS超載和凋亡啟動蛋白的釋放與抑制受損或不必要線粒體的清除有關，通過線粒體自噬可確保阿霉素所致的受損或不必要線粒體的選擇性清除。目前據文獻報道[10-11]，阿霉素誘導的心臟毒性中線粒體自噬受線粒體分裂及融合相關蛋白和線粒體自噬受體PINK1/Parkin、BNIP3/NIX、FUNDC1等調控。特別是自噬受體，它們有一共同特征，即具有和LC3相互作用的LC3結合位點，從而促使線粒體被包裹進自噬囊泡中，誘導線粒體自噬的發生，清除受損或不必要的線粒體，最終維持線粒體結構和功能的穩定。

2.1 線粒體分裂及融合相關蛋白

線粒體分裂由線粒體外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)上的蛋白質、裂變蛋白1(fission protein 1，FIS1)、線粒體分裂因子、線粒體動力蛋白49/50以及動力相關蛋白1(dynamin related protein 1，DRP1)相互作用介導。線粒體融合由OMM上的線粒體融合蛋白1與線粒體融合蛋白2(mitofusin 2，MFN2)或MFN2與MFN2的二聚引發的OPA1介導。其中MFN2在PINK1的介導下磷酸化，并將融合蛋白轉化為線粒體自噬受體，減少線粒體的融合，從而減輕細胞損傷。首次在阿霉素誘導的肝損傷中發現，線粒體分裂及融合和線粒體自噬機制的改變可防止阿霉素引起的肝毒性，而線粒體分裂可能作為一種自適應反應參與阿霉素介導的線粒體自噬的發生發展[12]。有研究發現[13]，在阿霉素誘導的心臟毒性中，盡管阿霉素降低了線粒體融合的初級調節因子OPA1的蛋白表達水平，但線粒體分裂的調節因子DRP1和FIS1的表達并沒有變化，引起線粒體碎片增加、線粒體自噬激活，而DRP1敲除后線粒體碎片減少、心肌細胞線粒體自噬通量降低、阿霉素誘導的心臟損傷減輕，這些現象表明線粒體分裂及融合，尤其是依賴于DRP1的線粒體分裂在阿霉素誘導的線粒體自噬中是必不可少的。

2.2 PINK1和Parkin

目前，PINK1/Parkin途徑介導的線粒體自噬是哺乳動物系統中研究最廣泛的途徑[14]。PINK1作用于Parkin的上游，是Parkin激活和募集去極化線粒體所必需的。在健康的線粒體中，PINK1作為線粒體靶向蛋白通過OMM定位的X線粒體外膜轉位酶(translocase of outer mitochondrial membrane，TOM)復合物和線粒體內膜定位的線粒體內膜轉位酶(translocase of inner mitochondrial membrane，TIM)復合物導入線粒體，并被早老素相關菱形樣蛋白降解而維持在低水平。而在受損的線粒體中，線粒體的去極化及膜電位的耗散可抑制貫穿于TIM/TOM復合體的PINK1導入線粒體，PINK1在OMM上積累并穩定在一個由TOM7、TOM40、TOM70、TOM20和TOM22組成的復合物中，從而將Parkin從胞漿招募到泛素化OMM蛋白的線粒體，最終激活線粒體自噬[15]。有研究發現[16]，在阿霉素誘導的心臟毒性中，阿霉素引起線粒體損傷并破壞PINK1/Parkin依賴性的線粒體自噬，通過促進Parkin向線粒體的積累，激活Parkin介導的線粒體自噬以維持線粒體功能，最終改善阿霉素對心肌細胞的損傷。因此，可猜測PINK1/Parkin途徑介導的線粒體自噬與阿霉素誘導的心臟毒性密切相關。

2.3 BNIP3和NIX

BNIP3是Bcl-2家族的成員，與DRP1和OPA1相關，促進線粒體分裂而抑制融合，同時BNIP3含有的LC3相互作用基序(LC3-interacting region，LIR)能夠通過促進LC3的表達，降低哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性，獨立影響線粒體自噬。NIX與BNIP3同源，是線粒體更新和程序性細胞死亡途徑的雙重調節因子，參與細胞內的線粒體自噬和細胞死亡。同時，NIX作為一種線粒體外膜蛋白，也含有定位于自噬體膜表面的LIR基序，可介導線粒體隔離進入自噬小泡，從而誘導線粒體自噬和清除損傷的線粒體。有研究發現[17]，在阿霉素誘導的心臟毒性模型中，BNIP3可轉移到線粒體，促進通透性轉變和去極化，誘導Parkin招募到線粒體，啟動線粒體自噬。此外，在哺乳動物細胞中，BNIP3觸發DRP1從胞漿向OMM轉運并招募Parkin，從而激發線粒體自噬以清除受損線粒體。可見，BNIP3介導的線粒體自噬依賴于心肌細胞中的Parkin募集，參與阿霉素誘導的心臟毒性的發生及發展。

2.4 FUNDC1

FUNDC1作為缺氧條件下哺乳動物細胞中的一種線粒體外膜蛋白，與內質網-線粒體接觸位點相互作用而被積累，通過LIR基序與自噬標記LC3結合發揮作用。在缺氧條件下，FUNDC1被SRC激酶和CK2在酪氨酸18和絲氨酸13的位點磷酸化時，降低了它對LC3的親和力；而被PGAM5或其他尚待鑒定的磷酸酶去磷酸化時，很大程度上增加了它與LC3或其他自噬基因的相互作用，從而啟動線粒體自噬[18]。迄今為止，僅研究過缺氧條件下誘導的線粒體自噬，而阿霉素對FUNDC1介導的線粒體自噬的作用仍有待確定[10]。不過，FUNDC1在線粒體分裂過程中也是DRP1的一個適配器，FUNDC1過表達可誘導線粒體分裂，而FUNDC1基因敲除則導致線粒體融合。

3 線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的作用

近年來，心臟組織中豐富的線粒體已被確定為阿霉素誘導心臟毒性發生的關鍵靶點之一[19]。目前，研究者通過大量體內外實驗對線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的作用進行了研究。首先，在阿霉素誘導的心臟毒性的體外研究中，Xu等[20]研究發現，1μmol/L阿霉素誘導心肌細胞24h后，阿霉素可通過誘導轉錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)功能異常來抑制溶酶體功能，從而破壞心臟自噬，心臟自噬過程的中斷導致ROS過量產生以及△ψm分離，最終使線粒體介導的細胞凋亡和死亡。說明缺陷的線粒體自噬在阿霉素誘導的心臟毒性中發揮損傷作用，而線粒體自噬的增加是降低細胞凋亡的有效手段，這也從反面證實了線粒體自噬可通過選擇性清除受損的線粒體對心臟發揮保護作用。此外，小劑量阿霉素誘導的心臟毒性與DRP1磷酸化抑制、mTOR磷酸化升高以及TFEB的表達受到抑制有關，通過DRP1/mTOR/TFEB途徑增加線粒體自噬可減輕阿霉素誘導的心臟毒性。大劑量阿霉素誘導的心臟毒性與細胞內的線粒體自噬增加有關，最終導致心功能發生障礙[10]。也有研究者發現[13]，DRP1抑制劑mdivi-1通過抑制線粒體分裂和線粒體自噬阻止了阿霉素的損傷作用。因此，上述研究表明線粒體自噬在阿霉素誘導的心臟毒性中發揮雙重作用：缺陷或過度的線粒體自噬可加重心肌損傷，而適量的線粒體自噬可通過線粒體自噬-溶酶體蛋白降解系統清除損傷的線粒體減輕心臟損傷，這可能是由于阿霉素劑量的不同導致的。

有趣的是，也有研究者發現線粒體自噬在阿霉素誘導的體外實驗中的雙重作用除了與阿霉素劑量有關外，可能還與細胞品系和孵育時間有關。例如，Liang等[21]研究表明，5μmol/L阿霉阿霉素誘導新生小鼠心室肌細胞24h后，阿霉素促進線粒體和溶酶體的共定位，誘導線粒體自噬。他們發現，在阿霉素刺激下LRRK2和Rab7水平升高，TOM20和TIM23水平降低，用線粒體自噬抑制劑蓮心堿處理后逆轉了這一現象，其Rab7水平的降低抑制自噬小體和溶酶體融合以抑制阿霉素刺激心肌細胞的線粒體自噬，從而減輕阿霉素引起的心臟功能障礙。相比之下，Xiao等[19]研究發現，在2μmol/L阿霉阿霉素誘導H9C2細胞24h后，Parkin的蛋白和mRNA水平均降低，用構建的質粒高表達Parkin可減弱細胞凋亡；用Ad-RFP-GFP-LC3轉染細胞發現，Parkin表達顯著增加了自噬小體和自噬溶酶體數量；Parkin過表達導致LC3顯著升高。他們認為Parkin過表達提高線粒體自噬可能保護了阿霉素誘導的心肌損傷。此外，Wang等[16]研究發現，1μmol/L阿霉阿霉素誘導新生大鼠心肌細胞12h后，透射電鏡圖像顯示很少有自噬小體吞噬線粒體，同時線粒體中的Parkin、LC3Ⅱ和p62蛋白水平以及Parkin和p62與線粒體的共定位均降低，SESN2過表達增加它們的表達和共定位，激活Parkin依賴性線粒體自噬保護心肌細胞免受阿霉素誘導的損傷。

同樣的，在阿霉素誘導的心臟毒性體內實驗中線粒體自噬亦發揮雙重作用。然而，線粒體自噬是一個動態過程，在阿霉素誘導的急性心臟毒性模型中并不僅是簡單的激活或抑制線粒體自噬，也關系到線粒體自噬通量的整個過程。Liu等[11]實驗發現，在阿霉素誘導的急性心臟毒性，阿霉素抑制Parkin的表達及其從胞漿到線粒體的易位，這損害了線粒體自噬，同時，阿霉素還破壞了線粒體自噬通量，而Rubicon缺失可改善阿霉素處理后心臟的線粒體自噬通量和線粒體自噬。相對的，在阿霉素誘導的慢性心臟毒性模型中，阿霉素處理后5d，Parkin/PINK1的表達水平降低，證明在這個時間點Parkin介導的線粒體自噬的吞噬功能降低；然而阿霉素處理后2周，這些蛋白的表達水平發生反彈，甚至超過對照組，同時線粒體分裂與線粒體自噬增加相關的FIS1蛋白的表達也增加[22]。因此，這些研究表明模型類型及處理時間的不同也可能是線粒體自噬雙重作用的原因。

綜上所述，線粒體自噬發生的“量”是保護或有助于阿霉素心臟毒性的關鍵。有文獻報道[19]，線粒體自噬在阿霉素誘導的心臟毒性中發揮的不同作用可能還與用于測量線粒體自噬的方法不同有關。然而，尚無足夠的實驗研究證實。因此，在將來研究線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的作用及調控機制時，需考慮到上述這些因素的影響，這對于臨床上防治阿霉素的心臟毒性有著重要的研究價值。

4 展 望

21世紀以來，阿霉素劑量依賴性和累積性誘發的不可逆的退行性心肌病和充血性心力衰竭等心臟毒副作用給患者帶來了極大的不利影響。因此，及時監測和調節線粒體自噬水平、了解影響線粒體自噬“量”變化的因素及機制、掌控線粒體自噬發揮保護作用的“量”以及維持線粒體的內環境穩態等措施在防治阿霉素心臟毒性方面至關重要。目前，哺乳動物細胞中線粒體分裂及融合相關蛋白、PINK1/Parkin、BNIP3/Nix以及FUNDC1等分子途徑，尤其是PINK1/Parkin途徑相關的線粒體自噬作為選擇性地清除細胞內結構損傷和功能障礙的線粒體或降解不必要的正常線粒體的一種方式，參與阿霉素心臟毒性的發生發展。然而，由于線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的作用及確切機制尚未完全闡明，故需針對線粒體自噬在阿霉素心臟毒性中的作用及機制做進一步研究，為臨床上阿霉素心臟毒性的防治提供新的理論依據和靶點。