細胞焦亡與肺部疾病的研究進展*

周其其，閔 清**，白育庭

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院臨床醫學院)

細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一種由基因調控的細胞死亡方式，它包括細胞凋亡(apoptosis)、細胞壞死(necrosis)、細胞焦亡(pyroptosis)、鐵死亡(ferroptosis)、自噬(autophagy)和胞葬(efferocytosis)6種方式[1]。自2001年Cookson提出并定義了細胞焦亡是一種新的細胞程序性死亡后，細胞焦亡受到大家的廣泛關注，據現階段文獻報道，細胞焦亡已涉及癌癥[2]、炎癥[3]、癲癇[4]、膿毒癥[5]等疾病的病變過程。研究表明，細胞焦亡在肺部疾病的發生發展中同樣具有重要的作用，包括肺癌、慢性阻塞性肺疾病、肺部炎癥以及肺結核。本文回顧近年來相關報道，對細胞焦亡在肺部疾病中的作用進行綜述。

1 細胞焦亡的概述

細胞焦亡是一種新型細胞程序性死亡，常伴隨著炎癥的發生，故又稱為細胞炎性壞死。細胞焦亡早期會出現染色質濃縮和DNA斷裂，之后細胞膜會形成大量壞死性孔隙，導致細胞膜喪失其完整性，一方面使得鈣離子和水進入細胞內，另一方面大量的細胞內含物和炎性因子向外漏(如IL-1β，IL-18等)，最終導致細胞破裂而發生焦亡。與細胞凋亡相比，雖然兩者都將發生核皺縮與DNA斷裂，但兩者本質區別在于細胞凋亡時細胞膜是完整的，不會釋放出炎性因子，而細胞焦亡則相反。故細胞焦亡具有獨特的分子機制與應用，具有研究價值。

2 細胞焦亡的分子機制

細胞焦亡與Caspases家族密切相關，Caspases家族為一種高度保守的天冬氨酸特異性半胱氨酸家族，目前已經有超過10個以上的成員。細胞焦亡最初被認為是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-1)介導的細胞死亡，隨著研究的深入，發現Caspase-3、4、5、8和11也能介導細胞發生焦亡。目前主流觀點認為細胞焦亡發生的機制主要分為Caspase-1依賴的經典途徑和Caspase-3、4、5、8和11依賴的非經典途徑。另外，有學者將細胞焦亡稱為由Gasdermins(GSDM)介導的炎性PCD，GSDM蛋白家族是介導細胞焦亡的一組重要蛋白，其在誘導細胞死亡和炎癥中具有重要作用。Caspases被激活后切割GSDM蛋白家族，GSDM釋放N末端結構域識別并在細胞膜上打孔，其改變了細胞滲透壓，使膜內外電解質失衡引起細胞腫脹破裂，進而釋放大量炎性因子和細胞內容物，招募免疫細胞進一步擴大炎癥反應，使細胞發生炎癥性死亡[6]。

2.1 細胞焦亡的經典途徑

Caspase-1依賴的細胞焦亡經典途徑，其關鍵蛋白與炎性小體緊密相關，炎性小體復合物是天然免疫防御過程中的重要組成部分，Caspase-1在細胞質中是以無活性的酶原形式(pro-caspase-1)存在，而炎性小體可以將其激活而發揮作用[7]。炎性小體是由模式識別受體(particular pattern recognition receptors,PRRs)作為支架蛋白構成的大分子蛋白質復合物[8]，主要包括4個主要原型NLR家族的吡啶域,即NLRP1、NLRP3、NLRC4、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)和吡啶(Pyrin)，這些炎癥小體通過各種刺激誘導焦磷酸化而使細胞發生焦亡。NLRP3作為細胞焦亡研究最廣泛的炎性小體之一而備受關注，其受體蛋白含有PYD、NACHT和LRR三個結構域，可以被一系列微生物和宿主來源的觸發因素激活，包括細菌、病毒和成孔毒素等。NLRP1介導的炎性小體是第一個被識別的分子平臺，可觸發Caspase-1激活人類巨噬細胞中IL-1β的分泌，主要參與針對炭疽芽孢桿菌的宿主防御機制[9]。與NLRP1類似，NLRC4(也稱為IPAF，CLAN和CARD12)包含CARD，可以直接與Caspase-1的CARD域相互作用，能被病原菌激活，是入侵細菌的關鍵胞質監視系統[10]。AIM2主要在細胞質中表達，屬于HIN-200家族，能夠通過PYD結構域和ASC相互作用，感測胞質細菌雙鏈DNA，AIM2感應DNA是非特異性的識別，當細菌病原體入侵后可以激活Caspase-1，導致細胞焦亡，這在感染和慢性炎癥中發揮著作用[11]。

2.2 細胞焦亡的非經典途徑

細胞焦亡非經典途徑中，革蘭氏陰性細菌產生的外膜囊泡(OMV)將細菌脂多糖(LPS)分子傳遞到細胞質中，并在體內和體外觸發人細胞中的Caspase-4或Caspase-5或在小鼠細胞中的Caspase-11依賴性效應反應。在LPS的作用下，裂解的Caspase-4或Caspase-5和Caspase-11也能激活Gasdermin-D在細胞膜上形成孔，然后在細胞外釋放IL-1β和IL-18，導致細胞焦亡的發生[12]。同時，Gastermin-D的N端片段激活NLRP3炎性體并通過經典途徑誘導細胞焦亡[13]。

2.3 GSDMD蛋白

GSDM蛋白家族由GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB59組成[14]，其中，GSDMD是細胞焦亡的關鍵蛋白，參與了細胞焦亡的經典途徑和非經典途徑。活化的Caspase-1和Caspase-11能夠在Asp276位點上切割GSDMD形成N端和C端兩個片段，即GSDMD-NT和GSDMD-CT，前者為主要的功能結構域，參與細胞的焦亡，后者具有自體抑制功能。重組的GSDMD可被視化為脂質體上的孔狀結構，這些孔可以使焦磷酸細胞的胞質內含物流出[15]，具體體現在當GSDMD被切割后，GSDMD-NT可能通過Caspase移除GSDMD-CT的抑制性結構域而從單體變成寡聚物轉移至細胞膜，GSDMD-NT與膜上的磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰絲氨酸連接而發生低聚化，產生氣孔使得炎癥因子很容易通過細胞膜，導致細胞發生腫脹最終誘導細胞焦亡。另外，也有研究表明[16]，Caspase-8也可以切割GSDMD誘導細胞發生焦亡。

3 細胞焦亡與肺部疾病之間的聯系

肺是人體中氣體交換的主要器官,在呼吸過程中，肺部可能遭受各種環境侵害，包括暴露于煙霧和微粒和病原體(如細菌、病毒和真菌)形式的異物。因此，氣道細胞(如肺泡巨噬細胞)常暴露于這些損傷下，可引發炎性體介導的免疫反應，單獨或與易感遺傳因素結合會導致肺臟發生病理改變[8]。越來越多的證據表明炎性小體在各種肺部疾病的發病機理具有關鍵作用，盡管炎性體介導的免疫反應(包括焦磷酸化和細胞因子分泌)對于宿主防御至關重要，但過量的炎性體介導的免疫反應會加劇組織損傷。

3.1 細胞焦亡與肺癌

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，是全球范圍內與癌癥相關死亡的主要原因，其預后不佳且5年生存率低于15%[17]，根據細胞起源和表型可將肺癌分為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，其中，NSCLC占肺癌病例的85%。Wang 等[18]研究辛伐他汀治療非小細胞肺癌可以通過激活NLRP3/Caspase-1/IL-1β和/IL-18而導致細胞焦亡，后續研究也建立了異種移植小鼠模型，結果表明，辛伐他汀通過激活Caspase-1誘導的焦亡來抑制異種移植小鼠模型中NSCLC腫瘤的生長，這為辛伐他汀作為抗腫瘤藥提供分子機制參考。Li 等[19]研究新型派隆清(PL)類似物L50377，除了比PL有更大的抑制癌細胞生長的潛力外，還發現L50377可以刺激細胞中活性氧(ROS)的生成，而ROS是維持細胞氧化還原穩態的活性小分子，可以介導焦亡、凋亡等各種細胞程序性死亡；該研究進一步發現ROS介導的NF-κB抑制與L50377誘導細胞焦亡的機制有關，但是否與細胞焦亡的其他途徑相關并未闡明。Zhang 等[20]通過體內和體外研究腫瘤抑制基因(p53)對NSCLC細胞焦亡的機制時發現p53表達水平與NSCLC細胞焦亡呈正相關，即p53的過表達增加了焦磷酸化水平，包括mRNA和蛋白質水平上的NLRP3，ASC和Caspase-1的上調，此外，使用了p53激動劑來激活p53，并且獲得了類似的結果；另外，該研究還用LPS處理人類肺癌細胞A549，結果表明LPS提高了p53水平，形成的NLPR3顯著增加，從而誘導細胞發生焦亡發生。盡管如此，p53作為細胞焦亡的關鍵因子還需要做進一步全面的研究。

3.2 細胞焦亡與慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是由呼吸道暴露于吸入刺激物(例如香煙煙霧)引起的，并導致呼吸道進行性炎癥性疾病，炎性體與COPD的發病機理密切相關，尤其是NLRP3研究較多。Wang 等[21]探討了全身和局部氣道NLRP3激活與COPD急性加重(AECOPD)之間的相關性，實驗包括32位吸煙者，65位AECOPD患者，50位處于恢復期COPD患者和30位處于穩定期COPD患者，結果表明與吸煙者相比，AECOPD患者發現NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-18、IL-1β的mRNA水平明顯升高，當同一組中的COPD患者變得臨床穩定時，這些NLRP3炎性體介質明顯減少，表明了全身和局部氣道NLRP3炎性小體激活與急性加重有關，NLRP3可成為COPD患者急性加重和臨床診斷的生物標志。Colarusso 等[22]研究炎性小體在COPD中的作用時提及NLRP3激活與COPD中氣道炎癥有關，而NLRP3炎性體激活劑中包括香煙煙霧，該文章指出NLRP3可能作為COPD發病機理中炎癥反應與免疫反應之間的聯系，但炎癥激活的確切機制仍不清楚，需要進一步研究。Yang 等[23]研究NLRP3在COPD過程中的作用時發現在COPD的小鼠模型中，NLRP3基因的缺乏阻止了長期吸煙的小鼠中COPD的發展，因此，作者提出NLRP3炎性體對于COPD的發展至關重要，而NLRP3的阻斷是COPD的一種可能的治療策略。

3.3 細胞焦亡與肺部炎癥

作為病原體傳感器，炎性體復合物在宿主防御肺部感染中具有特別突出的作用。當肺部感染細菌性肺炎時，細菌顆粒會提供胞質病原相關分子模式(pathogen associated molecular，PAMP)，其與肺巨噬細胞上的NLR結合并激活不同的炎癥小體復合物，從而導致IL-1β和IL-18的產生。除了觸發肺中的炎性細胞因子外，多種炎癥小體復合物還引發焦磷酸化[24]。He 等[25]探討了LPS誘導的IL-1β釋放和白細胞介素-1受體I型(interleukin-1 receptor I type，IL-1RI)上調對肺部炎癥發展的影響，該研究證明在肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage,AM)中，LPS-TLR4信號不僅激活NLRP3炎性小體，導致細胞釋放IL-1β，而且也可通過MyD88和NF-κB依賴性信號上調AM表面的IL-1RI表達。因此，上調的IL-1RI使AM對IL-1β敏感并導致焦小體形成，進而導致AM焦磷酸化，這是一種Caspase-1依賴性炎性細胞焦亡。該研究證明了IL-1β-IL-1RI信號的繼發上調是AM焦亡和LPS應答引起肺損傷的重要原因。Ceballos-Olvera 等[26]用了大量的實驗探討了假小芽孢桿菌與炎癥小體的相互作用，采用類鼻疽病的基因敲除小鼠模型，結果顯示兩種不同炎癥小體被假性麥芽孢桿菌感染激活，一種是Nod樣受體NLRP3，可介導IL-1β和IL-18；另一種是NLRC4的NLR，可介導焦磷酸化，細胞焦亡和IL-18的產生對抵抗假芽孢桿菌同樣重要。NLRP3和NLRC4炎性小體在類鼻疽病中具有獨有的作用，NLRC4主要在感染的早期和誘導細胞焦亡，而NLRP3主要調控IL-1β和IL-18的分泌。Zhao 等[27]提出當免疫功能低下的宿主暴露于革蘭氏陰性細菌(如銅綠假單胞菌)時，肺巨噬細胞中Caspase-1通過NLRC4炎性小體復合物被激活，使得IL-1β和IL-18增加，最終導致細胞死亡。

3.4 細胞焦亡與肺纖維化

肺部纖維化疾病不是特定的疾病實體，而是代表不同病理過程的異質集合的最終結果。肺纖維化的發展與年齡的增加密切相關，大多數病例是發生在50歲以上的中年人，肺纖維化早期，肺部炎癥表現為各種炎癥細胞浸潤，肺泡巨噬細胞活化，毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞損傷[28]，Hussain 等[29]研究發現多壁碳納米管MWCNT以時間和劑量依賴性方式誘導HBE細胞中NLRP3炎性體依賴性焦亡，來自MWCNT處理的HBE細胞的條件培養基誘導人肺成纖維細胞中促纖維化標記物(如TIMP-1、腱生蛋白C、前膠原1和骨橋蛋白)的mRNA表達顯著增加，而TGF-β的表達卻沒有隨之變化。當將IL-1β、IL-18和IL-8中和抗體添加到條件培養基中或使用來自NLRP3 siRNA轉染的HBE細胞的條件培養基時，促纖維化標記物的誘導顯著降低，表明NLRP3可能參與了肺纖維化的發生發展。王鵬飛等[30]研究黃芪甲苷對特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)小鼠時測定了Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達，結果表明黃芪甲苷能降低Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白表達的表達水平，其機制可能與抑制細胞焦亡有關。

3.5 細胞焦亡與肺結核

結核病是由結核桿菌引起的慢性傳染病，結核桿菌主要入侵肺部，稱為肺結核。目前，由結核分枝桿菌感染引起的結核病仍然是全球公共衛生的威脅，Gong 等[31]研究了結核分枝桿菌PPE60在分枝桿菌的存活中發揮作用，并且這種能力與LUBAC、NF-κB信號傳導和宿主細胞焦亡有關，該研究分別測定了細胞凋亡與細胞焦亡的相關蛋白，發現Caspase-1/4、NLRP3和GASDERMIND的mRNA水平顯著增加，而與線粒體破裂相關的標記蛋白Mfn2未出現明顯增加，表明Ms-PPE60可能促進細胞焦亡而不是細胞凋亡。Danelishvili 等[32]研究結核分枝桿菌在被吞噬細胞攝取后會過表達操縱子Rv3361c，可分泌Rv3364c，Rv3364c蛋白與膜上的絲氨酸蛋白酶組織蛋白酶G結合，抑制Caspase-1激活，從而抑制宿主細胞的焦亡。另外，也有學者提出肺結核與多種細胞死亡方式有關，結核分枝桿菌可通過細胞凋亡、細胞壞死、自噬和細胞焦亡等方式影響細胞[33]。

4 展 望

肺臟作為人類的呼吸器官，關于治療肺部相關疾病有非常重要的意義，而肺部疾病的發生發展卻是非常復雜的病理過程，其發病機制錯綜復雜，細胞焦亡在作為近年來新型的細胞程序性死亡方式，其肺部疾病的研究中備受關注。特別是炎性小體，但炎性小體的強大免疫功能可能是有益的或有害的，根據不同的肺部疾病可能其功能是不一致的，因此，需要在其臨床背景下考慮該途徑的治療作用。鑒于細胞焦亡在疾病的發病機理中具有廣泛而有效的作用，因此，進一步研究細胞焦亡的確切機制可能為治療和診斷多種肺部疾病提供新的可能性和新的靶點。