植物多糖的分離研究進展

柯欽豪，馬慧敏，曹 琴，王世越，周宏福，鄭 敏

(湖北科技學院，湖北 咸寧 437100)

植物多糖由十個以上單糖通過糖苷鍵連接而成，能通過水提取、超聲波提取、堿提取、酶輔助提取、微波輔助提取和超臨界流體萃取[1]等方法獲得。研究報道，植物多糖具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗氧化[2]等多種生物活性，現已廣泛應用于醫療保健行業。但提取純化后的植物多糖仍然是一個含有多種多糖的混合體系，對后續的定性等結構表征分析及生物活性分析帶來很大的影響，所以，植物多糖的分離為多糖研究的重要部分。目前為止，植物多糖的分離分為初步分離和精細分離，初步分離的方法包括鹽析法、分級沉淀法、膜分離法等；精細分離的方法包括凝膠柱色譜法、離子交換柱色譜法、離子交換柱色譜和凝膠柱色譜聯用法、親和色譜法、高效逆流色譜法等。我們以近十年植物多糖分離的相關研究成果作為基礎，對植物多糖的分離進行綜述，為深入研究提供科學依據。

1 初步分離

多糖是聚合程度不同的物質的混合體系，其分子量范圍從幾千到幾千萬，其純度用“均一多糖”來表示，不同于一般化合物，“均一多糖”為一定分子量范圍的均一組分，代表某一多糖的相似鏈長的平均分布。

多糖的分離就是將多糖這一混合體系分離成成分更加均一的多糖，其中分離方法較為粗獷的為初步分離，主要有鹽析法、分級沉淀法、膜分離法等。

1.1 鹽析法

鹽析法分離多糖常用到季銨鹽，季銨鹽為一種乳化劑，在水中能形成陽離子，可與酸性多糖陰離子形成不溶于水的沉淀，再經過過濾就得到了中性及堿性多糖溶液和酸性多糖沉淀，再向溶液中加入堿性物質如硼砂緩沖液，則中性多糖沉淀，最終可以得到酸性多糖、中性多糖及堿性多糖。

鹽析沉淀后，可以取沉淀和上清，分別濃縮，得到兩個多糖組分，如張瑞妮等[3]將提取得到的柿子多糖與3%的十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)混勻，靜置得到沉淀和上清兩個多糖組分。秦垂新等[4]以中藥口服液為原料，利用CTAB沉淀法，得到了沉淀酸性多糖組分和上清中性多糖組分。還可以沉淀后只取沉淀的多糖組分，如何偉珍等[5]用季銨鹽沉淀法分離銀耳多糖。沉淀多糖的物質也可以是十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)的堿(CTA-OH)和十六烷基吡啶。同樣可以用硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、醋酸鉀等進行鹽析分離多糖。還有金屬絡合物法，也可以將多糖沉淀出來，如用費林溶液、氯化銅、氫氧化鋇、醋酸鉛等[6]。鹽析法操作簡單，節約成本，根據多糖酸堿性分離多糖，但不足之處是分離后得到的多糖組分均一性不夠高，只適用于多糖的初步分離。

1.2 分級沉淀法

多糖在甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑中的溶解度與多糖的分子量、聚合度及有機溶劑的濃度等因素有關，有機溶劑會破壞多糖的氫鍵，進而破壞多糖的二級結構，使多糖的溶解度降低。一般隨著有機溶劑濃度的增加，多糖會按分子量從大到小依次被沉淀下來，這種分離多糖的方法就叫分級沉淀法。

乙醇毒性小且可回收，為分級沉淀法較常用的有機溶劑。景永帥等[7]向熱水浸提的多糖濃縮液中加入一定體積的乙醇，使乙醇終濃度為30%、50%及70%，依次得到了不同乙醇濃度下沉淀的多糖。分級沉淀法的特點與鹽析法類似，分離后得到的多糖組分均一性不夠高，不同之處為分級沉淀法分離得到的多糖分子量接近，而鹽析法分離得到的多糖酸堿性接近。

1.3 膜分離法

以選擇透過性膜為分離介質，多糖或其中的雜質在壓力差、化學位差或電位的推動力作用下，將能透過膜的和不能透過膜的成分分開。根據選擇透過性膜孔徑由大到小可分為微濾、超濾、納濾和反滲透膜。其中超濾還可以進一步選擇可通過的物質的分子量，進而對多糖進行分離，而且還可以除去粗多糖中的鹽及小分子物質。

Du 等[8]通過微孔超濾系統，用500、100、10kDa分子量的選擇透過性膜對多糖進行過濾，依次得到了較純的銀耳多糖組分TAP50w、TAP10-50w、TAP1-10w。還可以通過微濾法，除去粗多糖中比膜孔大的微粒及微生物。膜分離法成本低，操作簡單，節能環保，可在室溫下進行，缺點是部分多糖對濾膜有一定的吸附作用。

2 精細分離

2.1 凝膠柱色譜法

凝膠是一種特殊的分散體系，其中，膠體粒子或高分子形成空間網狀結構，結構間隙充滿了作為分散介質的液體。凝膠又可分為彈性凝膠和脆性凝膠。彈性凝膠失去分散介質后體積顯著縮小，吸收分散介質后體積又顯著膨脹，如明膠、聚酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、聚酰胺葡聚糖凝膠、葡聚糖瓊脂糖凝膠等，這類凝膠使用前常需要進行活化及緩沖液浸泡。脆性凝膠失去或吸收分散介質，其性狀和體積均不發生改變，如硅膠等。凝膠根據分子篩原理分離物質，含有各種分子的樣品溶液緩慢流經色譜柱時，大分子物質由于直徑較大，只能通過顆粒之間的間隙向下移動，速度較快。小分子物質還可進入凝膠顆粒的微孔中，在向下移動的過程中，從一個凝膠內擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒的微孔，速度較慢，即小分子物質的下移速度慢于大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，分子小的后流出。

2.1.1 瓊脂糖凝膠柱色譜法

瓊脂糖是半乳糖的線性多聚物，溶于水后在35℃～40℃時形成良好的半固體狀凝膠。Lin等[9]通過Sepharose 6B凝膠柱色譜法將番石榴種子粗多糖分離出了3種蛋白質多糖。瓊脂糖還為一種強陰離子型凝膠，能夠結合酸性多糖。瓊脂糖不但能將脂多糖和一般多糖分離，還能夠將脂多糖與色素進行分離，如陳正行[10]分離米糠多糖得到了純度99.5%純度的米糠脂多糖。崔杰等[11]將得到的莼菜多糖1和莼菜多糖3進行純化時使用瓊脂糖凝膠柱Sepharose CL-6B，證明了莼菜多糖1和莼菜多糖3組分較為均一。

2.1.2 葡聚糖凝膠柱色譜法

葡聚糖凝膠是葡聚糖和甘油基交聯形成的一類凝膠。梁宇芝等[12]將羊肚菌胞內多糖與胞外多糖分別用葡聚糖凝膠G-100柱分離，均得到了5個多糖組分。吳金松等[13]將得到的信陽毛尖茶多糖用濃度梯度的NaCl洗脫Sephadex-G100葡聚糖凝膠柱，得到了3個多糖組分，然后再用Sephadex-G150葡聚糖凝膠柱進行多糖純度的鑒定，最終得到了一種純度為92.4%的多糖。瓊脂糖凝膠柱色譜法和葡聚糖凝膠柱色譜法所需設備簡單、操作方便、不需有機溶劑，且對多糖及其他高分子物質有很好的分離效果，應用廣泛。

2.2 離子交換柱色譜法

DEAE(二乙基氨基乙基)與不溶性的葡聚糖、瓊脂糖或纖維素等交聯結合后，形成DEAE-纖維素和DEAE-瓊脂糖凝膠等，DEAE在水中可形成不溶性的陽離子物質，對不同多糖在水中電離產生的陰離子的吸引力不同，通過增強洗脫溶劑的離子強度或改變洗脫溶劑的pH值，可以依次按與離子交換柱吸引力從弱到強的順序洗脫出不同的多糖。此方法適合用來分離中性多糖和酸性多糖，常用的洗脫溶劑為濃度梯度的NaCl水溶液等。

DEAE-纖維素適合用來分離酸性多糖、中性多糖和粘多糖，多糖對DEAE的吸附力隨著多糖酸性基團的增多而增強，用濃度梯度的鹽溶液或堿性溶液洗脫，即可依次得到不同酸性的多糖。Li等[14]通過DEAE-52纖維素色譜柱，分別用0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.8mol/L的NaCl溶液洗脫熱水浸提、超聲輔助提取及酶提取法提取得到的kurome昆布多糖，均得到了6個多糖組分。

劉衛寶等[15]將得到的黃芪粗多糖用DEAE瓊脂糖凝膠柱DEAE Fast low進行分離，得到了兩個純化的多糖組分。孟祥勇等[16]將得到的黃酒多糖用DEAE-Sepharose FF色譜柱進行分離純化，得到了3種黃酒多糖組分。這種分離多糖的方法污染小，分離出來的多糖純度高，不足之處是洗脫液體積大，后處理較為麻煩費時。

2.3 離子交換柱色譜法和凝膠柱色譜聯用法

近年來越來越多的文獻報道，先通過DEAE色譜柱將植物多糖分離成若干個組分，然后再用凝膠柱色譜法進行進一步的分離或純化。如裴若楠等[17]先用DEAE-52離子交換層析柱分離得到石花菜多糖1，然后用Sephadex G-200層析柱進一步純化多糖。這種兩種色譜柱聯用的方法，能得到分離更徹底的多糖組分，分離效果佳，得到的多糖組分多為均一多糖。

2.4 親和色譜法

生物分子間存在很多特異性的結合力，這樣一對的分子常稱為配體與受體，配體與受體的這種結合力又被稱為親和力。親和色譜就是將配體以共價鍵固定在不溶性基質中，再將不溶性基質裝填成色譜柱，用含有受體的溶液洗脫色譜柱時，受體會被吸附在固定相上，其他物質被洗脫下來，再用適當的洗脫液將受體洗脫下來，就得到了只含有受體和洗脫液的物質，進而分離得到只含有受體的單一成分。

王啟龍[18]首先將酰化的CNTm(復壁碳納米管)與硅烷化的硅膠(SiO2)反應制成CNTm@SiO2復合物，然后將人單核細胞誘導產生的巨噬細胞(Mφ)通過蔗糖濃度梯度溶液超速離心法獲得脂筏，冰水浴條件下向Mφ脂筏溶液及XOD(黃嘌呤氧化酶)中加入CNTm@SiO2復合物，就分別得到了Mφ@CNTm@SiO2和XOD@CNTm@SiO2親和色譜柱裝柱材料。低壓裝柱后，篩選多糖的免疫活性，分別篩選出了7種與Mφ及XOD有免疫活性的植物多糖。路垚等[19-20]發現金銀花多糖能與凝集素發生凝集反應，推測能與凝集素發生凝集反應的就是活性多糖，于是以蓖麻油凝集素為親和載體，制備親和色譜柱，并得到了由3種不同分子量混合而成的親和活性多糖。親和色譜法除了可以用來分離多糖，還可以除去多糖中特有的雜質，如張娟娟等[21]用Affi-Prep Polymyxin柱親和色譜除去魚腥草總多糖中的內毒素。親和色譜法的優點是分離得到的多糖組分有較好的同等生物活性，適合用來進行生物活性實驗，缺點是色譜柱的制作較為復雜，技術難以掌握，所以使用并不廣泛。

2.5 高效逆流色譜法

高效逆流色譜法發展自多級萃取技術，通過自轉和公轉(同步行星式運動)產生的二維力場使兩相容劑萃取頻率及效率大為提高。不相溶的上下兩相平衡溶液在螺旋管內交替分布，當螺旋管高速轉動時兩相溶液分別占據螺旋管的兩端(首端與尾端)，將首端溶液從尾端注入后會迅速回到首端，不斷地進行萃取，最終根據分配系數的不同實現樣品的分離[22]。現有的高效逆流色譜儀上樣量從數十微克到數十克不等，且其分析能力可與高效液相色譜相媲美，現已廣泛應用于花色苷、多糖及其他天然產物的分離純化[23]。

Yu等[24]利用高效逆流色譜純化Anoectochilus roxburghii(wall)多糖，得到了純度為95.01%的多糖。王曉麗等[25]根據分配系數測定實驗，得出了當聚乙二醇∶磷酸二氫鉀∶磷酸氫二鉀∶水比例為5∶15∶15∶65時加入2%NaCl，可分離蘆薈粗多糖得到兩個多糖組分，經葡聚糖凝膠柱色譜及凝膠滲透色譜分析，確定這兩個多糖組分的成分均一。此方法不會用到任何的固態支撐體，不會造成樣品被污染、生物活性改變，而且避免了分離的物質被固相載體吸附導致樣品的損失，并且有機溶劑使用少，可同時實現純化和分離，具有重現性好、操作簡單、用時較短的優點。

3 展 望

通過綜述以上多糖的分離方法，發現各有特點。鹽析法和分級沉淀法分離操作簡單，所用耗材試劑常見，但其分離的組分常純度不夠，無法得到均一多糖。膜分離法操作簡單，分離效果也較好，但對多糖有一定的選擇性，部分多糖容易黏附膜孔，采用此法時分離效果不佳。凝膠柱色譜法分離效果較好，能分離出不同分子量范圍的多糖，現已廣泛應用。離子交換柱色譜法可以根據多糖酸堿性的不同分離多糖，也較常用。凝膠柱色譜法及離子交換柱色譜法分離多糖效果均較好，常進行聯用，以取得更好的分離效果，現應用較廣泛。親和色譜法為近年來發展起來的根據多糖對生物細胞或組織的親和特性，將多糖進行分離，分離效果好，并且尤其適合用分離出來的多糖進行生物實驗，但缺點是色譜柱的制作方法較為復雜，難以掌握。高效逆流色譜法分離多糖的方法用時較其他方法較為短暫，并且分離效果好，重現性好，但缺點是分離設備昂貴，難以普及。

隨著近年來植物多糖被研究得越來越深入，多糖在醫療上的價值越來越高。但多糖是一類結構復雜的生物大分子，為聚合程度不同的物質的混合物，而且多糖還可以與蛋白質、油脂類以糖苷鍵結合成為糖蛋白、脂多糖等。所以，操作簡單、分離效果好的多糖分離方法尤為關鍵。隨著各種多糖分離技術在研究中的應用，越來越多具有生物活性的多糖被發現并進行分離純化，相信隨著對多糖研究的進一步深入，多糖的結構及藥效關系會取得進一步的闡明，植物多糖的開發和應用會得到不斷拓寬和發展，以便于更好地應用于食物、保健及醫藥領域。