替米沙坦對高血壓大鼠心肌纖維化的抑制作用*

周慧芬，李 勇，孔維浩，趙辛元

(1.湖北科技學院基礎醫(yī)學院，湖北 咸寧 437100；2.咸寧市衛(wèi)生服務中心；3.湖北科技學院臨床醫(yī)學院)

高血壓是臨床常見的慢性病，是心腦血管病最主要的危險因素，嚴重危害人民的健康。長期的壓力負荷可通過心臟、血管結構和功能的改變，引起左心室心肌重塑和心室纖維化，包括心肌細胞肥大、凋亡和胚胎基因、蛋白質的再表達[1]。其中，心室重塑是指心室?guī)缀巍①|量、體積和功能的變化，以適應心肌損傷或負荷的變化，病理性心室重塑程度是預測心臟病預后的有力證據(jù)[2]；心肌纖維化是指心肌間質膠原濃度升高及膠原特性構型改變[3]，它是高血壓后期心肌重塑的關鍵病理特征之一，也作為高血壓病程中出現(xiàn)心肌缺血、心律失常甚至心源性猝死的重要原因[4]。血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)可減少心血管疾病(CVD)事件[5]。ARB替米沙坦通過血管緊張素Ⅱ AT1受體阻滯和過氧化物酶體增殖物激活的受體γ(PPARγ)激活來減輕炎癥[6]，而炎癥是高血壓進程中心肌纖維化重要表現(xiàn)。本研究通過建立高血壓的大鼠模型，探討替米沙坦治療對心肌纖維化的抑制作用及可能機制，為臨床早期干預并治療心肌纖維化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

12周齡雄性SD大鼠28只，體重(220±20)g，由武漢大學ABSL-3實驗動物中心提供，分籠(4只/籠)飼養(yǎng)于標準動物房(23℃)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水，以及規(guī)律光照(晝夜各12h)。替米沙坦試劑購于上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司(80mg)。MMP-1、TIMP-1單克隆抗體，膠原Ⅰ、膠原Ⅲ單克隆抗體，SP試劑盒，DAB顯色試劑購于武漢博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 高血壓模型的建立及分組

大鼠隨機分為空白對照組(n=7)、假手術組(n=7)及模型組(n=14)。模型組采取二腎一夾法[5]建立高血壓大鼠模型，建模成功的大鼠隨機分為模型組、替米沙坦治療組(以下簡稱治療組)，每組各7只。治療組給予替米沙坦(30mg/kg)灌胃，其它3組給予同體積的生理鹽水灌胃，1次/d，每周測量一次血壓，連續(xù)8周。

1.2.2 組織稱重并取材

禁食12h，每只動物稱取體重(BW)后，乙醚麻醉，解剖后迅速取出心臟，稱心臟(HW)和左心室(含室間隔)重量(LVW)，心臟體重指數(shù)為HW/BW(mg/g)，左心室體重指數(shù)為LVW/BW(mg/g)；取適當大小的左室心肌組織迅速投入10%甲醛固定。

1.2.3 心肌組織染色并觀察

取10%甲醛固定好的左室游離壁處心肌組織常規(guī)HE染色，光鏡下觀察心肌細胞及心肌間質的變化。使用免疫組織化學SP法染色[5]，檢測心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達及基質金屬蛋白酶1(MMP-1)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)的表達，用已知的陽性切片同一條件下染色作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照顯微鏡觀察，胞漿呈棕黃色顆粒表明免疫組化陽性，每張切片隨機選取5個視野，Olympus BX50顯微鏡攝像系統(tǒng)攝像，采用高清晰彩色圖文報告分析系統(tǒng)分析，以5個視野的光密度(OD)的平均值作為各標本的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 替米沙坦對高血壓大鼠血壓、HW/BW、LVW/BW的影響

實驗結果顯示：與空白對照組相比，假手術組血壓值、HW/BW、LVW/BW變化不明顯(P>0.05)，其它兩組數(shù)據(jù)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組的血壓、HW/BW、LVW/BW則明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠收縮壓、HW/BW、LVW/BW的改變

2.2 替米沙坦對大鼠心肌心肌纖維化的影響

實驗結果顯示：心肌組織通過HE染色并在光學顯微鏡下觀察(圖1，封二)，空白對照組或假手術組心肌組織結構正常，無明顯間質纖維增生，而模型組、治療組心肌組織結構較凌亂，間質纖維增生明顯，但治療組心肌間質纖維增生較模型組顯著減輕。

2.3 替米沙坦對大鼠心肌組織Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原表達的影響

通過免疫組織化學染色對心肌組織Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原表達的檢測(圖2，封二)，在光學顯微鏡下觀察，空白對照組、假手術組心肌組織的Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原陽性表達不明顯，而模型組的陽性表達顯著，但經替米沙坦治療后其表達又明顯減弱；通過OD值比較(表2)，模型組、治療組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達的OD值明顯高于空白對照組或假手術組(P<0.05)，而治療組又顯著低于模型組(P<0.05)。

表2 實驗大鼠心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-1及TIMP-1的OD值

2.4 替米沙坦對大鼠心肌組織MMP-1及TIMP-1表達的影響

結果顯示：通過免疫組織化學染色對心肌組織MMP-1及TIMP-1表達的檢測(圖3，封二)，在光學顯微鏡下觀察，模型組心肌組織的MMP-1的陽性表達明顯弱于空白對照組或假手術組，而治療組的陽性表達較其他組明顯增強；模型組心肌組織的TIMP-1的陽性表達明顯強于空白對照組或假手術組，而治療組的陽性表達較模型組明顯減弱。

通過OD值比較(表2)，模型組心肌組織MMP-1表達的OD值明顯低于空白對照組或假手術組(P<0.05)，治療組則明顯高于其他組(P<0.05)；模型組心肌組織TIMP-1表達的OD值明顯高于空白對照組或假手術組，而治療組則明顯低于模型組(P<0.05)。

3 討 論

本研究通過結扎腎動脈造成腎動脈狹窄，以建立高血壓大鼠模型，術后2周收縮壓開始上升，4周穩(wěn)定，參考文獻標準[7]，當收縮壓持續(xù)超過160mmHg，且上升值大于30mmHg時，模型建立成功。

據(jù)文獻[8]報道，作為高血壓并發(fā)癥嚴重程度的敏感指標，左心室肥厚(LVH)是老年高血壓患者心血管事件的獨立危險因素；本研究實驗結果顯示，模型組的HW/BW、LVW/BW均明顯高于空白對照組或假手術組，提示高血壓引起大鼠左室明顯肥厚。另有文獻報道[9]，隨著高血壓LVH程度的進行性加重，心肌間質膠原纖維蛋白顯著增多。膠原蛋白為心肌間質基質的主要成分，由Ⅰ型和Ⅲ型膠原構成，其中80%以上為Ⅰ型，Ⅲ型僅占11%左右，此外還有少量Ⅳ型及V型膠原等[10-11]。本研究結果顯示模型組大鼠的心肌組織結構較凌亂，有明顯的局部纖維化，而且其Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達均明顯高于空白對照組及假手術組，提示高血壓引起了心肌纖維化。此外，心肌纖維化是心肌重構的關鍵，近年研究發(fā)現(xiàn)[12]，基質金屬蛋白酶(MMPs)在心肌組織中的大量表達，能特異性地降解細胞外基質(ECM)，同時組織抑制劑(TIMPs)及一些細胞因子調控MMPs的產生，所以MMPs/TIMPs的比例失調是導致心肌纖維化的重要因素。本研究同樣顯示，模型組相對于空白對照組或假手術組，其心肌組織的MMP-1表達上升，而TIMP-1表達則顯著下降(P均<0.05)，說明它們在高血壓引起的心肌纖維化過程中起重要的調節(jié)作用。

替米沙坦是非肽類血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，通過阻滯特異性血管緊張素受體，干擾RAAS的活性，降低人體血壓[13]，目前已有文章[14]報道，血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(ARB)能有效降低血壓，作為一種新型的降血壓藥物用于輕到中度的高血壓治療[15]，但對于ARB逆轉高血壓心臟重構，減少或防止MF的發(fā)生，尚存較多問題：①心肌纖維化的發(fā)生機制目前還未完全闡明，故缺乏特異的治療藥物針對心肌纖維化；②國外有報道在高血壓早期就發(fā)現(xiàn)有心肌纖維化的組織學證據(jù)[16]，故早期干預心肌纖維化具有重大意義，但是否能讓患者受益更多還需要進一步的研究；③現(xiàn)今大部分的藥物研究還停留在動物實驗和小樣本臨床試驗的階段，仍需要大規(guī)模多中心臨床試驗進一步驗證。在研究中，替米沙坦治療組相對于模型組，其收縮壓、HW/BW及LVW/BW顯著降低，心肌間質Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達水平明顯下調，且心肌組織MMP-1水平升高而TIMP-1水平降低，說明替米沙坦可能通過MMPs/TIMPs機制抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原的生成，從而減輕心肌間質纖維化及左心室肥厚。本研究結果可以為臨床早期干預或治療高血壓性心肌纖維化提供一定的實驗依據(jù)。