海藻糖對糖尿病小鼠胰腺凋亡及焦亡作用*

晏曉君，邱 鵬，查文良，余 薇，周 云**

(1.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學院臨床醫學院)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種因胰島素絕對或相對不足而導致的以長期血糖水平增高為特征的代謝性疾病。根據調查顯示，目前全球有4億多DM患者，中國已成為僅次于美國DM有關的保健支出總額最多的國家，DM經濟負擔嚴重[1]。DM的危害主要來自并發癥，且會導致高致死率和高致殘率。而DM中常見的特征為胰島素抵抗、高胰島素血癥、β細胞功能障礙及衰竭等。目前對DM的治療以調控血糖為主，但隨著用藥時間的延長，耐藥性的出現，降糖效果不佳，引發組織損傷并導致功能改變。因此，在DM環境中開展藥物治療作用的研究，為新的治療方法提供可靠的實驗依據尤為重要。

海藻糖(trehalose，TLS)為非還原性二糖，廣泛存在于各種生物體中，對生物活性物質具有非特異性的保護作用[2]。TLS可通過抑制炎癥和蛋白水解因子的表達，恢復眼表完整性以及干燥環境下的眼睛角化[3]。TLS還可通過抑制線粒體功能障礙和激活Bcl-2家族中關鍵的促凋亡成員而阻斷高糖誘導的神經細胞凋亡[4]。有研究報道[5]，TLS在很大程度上可使小鼠脂質代謝正常化，并減輕胰腺炎反應。我們前期研究發現，在引起DM心肌病的因素中，心肌細胞凋亡是重要發病環節[6]。基于此，本研究以小鼠腹腔注射STZ誘導DM模型，探討TLS對胰腺功能的影響，以及改善高糖小鼠凋亡和焦亡的作用機制，為預防和治療DM誘導的胰腺損傷提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性C57BL/6J小鼠60只，5～6周齡，體質量20～25g，由湖北省實驗動物研究中心提供，動物合格證號：SCXK(鄂)2015-0018。確保飼養房溫度20℃～25℃，相對濕度為(40±5)%，通風，進行光照晝夜循環，標準動物飼料和飲用水喂養，適應環境1周后，開始進行實驗。

1.1.2 藥品與試劑

TLS購于武漢漢宇飛揚科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)購自Sigma公司；Bax、Cleaved-Caspase-3、Bcl-2抗體購于Cell Signaling Technology公司，NALP3、Caspase-1、IL-18及IL-1β抗體購于北京博奧森公司。其余均為進口或者國產分析純化學試劑。

1.1.3 實驗設備與儀器

多功能酶標儀(瑞士TecanSpark)，電子天平，3-18K高速冷凍離心機(德國Sigma)，電泳槽和轉膜儀(美國Bio-Rad)，化學發光成像系統(美國Chemi-Doc)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥方法

60只C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組(Con組，n=15)、DM模型組(DM組，n=15)、TLS對照組(TLS組，n=15)和TLS治療組(DM+TLS組，n=15)。DM組和DM+TLS組連續5d腹腔注射由檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.4)配制而成的0.5% STZ溶液(50mg/kg)，分別在STZ注射后3d和7d進行尾靜脈血糖測定，分別測得血糖值≥16.7mmol/L則視為DM小鼠造模成功。而Con組和TLS組用相同方法給予等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。Con組和DM組進行接連2d等量生理鹽水腹腔注射，間隔4周。而TLS組和DM+TLS組進行連續2d TLS[1mg/(g·d)]腹腔注射，間隔4周，同時再采用飲水給藥2%TLS，共飼養24周[7]。

1.2.2 Western blotting法檢測蛋白

取小鼠胰腺組織，裂解液充分裂解后，離心取上清液測定蛋白濃度，電泳轉膜及封閉后根據不同抗體的效價，置于一抗4℃孵育過夜，二抗室溫1h孵育后用化學發光儀進行底物顯色，應用image lab軟件進行灰度值分析。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 各組小鼠胰腺組織凋亡蛋白表達情況

DM組Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表達水平相比Con組明顯升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白相對表達率明顯降低(P<0.05)；DM+TLS組Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表達水平與DM組相比顯著降低(P<0.05)；TLS組凋亡蛋白相比Con組無明顯差異(P>0.05)，見圖1。

與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

2.2 各組小鼠胰腺組織焦亡蛋白表達情況

DM組NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表達水平與Con組相比顯著升高(P<0.05)；DM+TLS組顯著逆轉了上述改變(P<0.05)；TLS組焦亡蛋白水平相比Con組差異不明顯(P>0.05)，見圖2。

與Con組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

3 討 論

DM的發生發展均伴隨著胰腺功能的進行性減退，高糖狀態會造成自噬水平異常，導致胰島細胞凋亡[8]。胰島是胰腺的內分泌部分，胰島素是胰島β細胞分泌的蛋白類激素。胰島素的作用是降低血糖，其能否正常發揮功效在DM的發病機制中占有重要的作用。DM的發生可導致胰腺中半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(caspase-3)和焦亡蛋白IL-1β增加，以及β細胞功能障礙引起的胰島素分泌受損和胰島素抵抗增加[9]。STZ誘導的DM是以β細胞受損和胰島素分泌減少為特征，在β細胞功能障礙的起始過程中，細胞炎癥小體激活半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1(caspase-1)并促進促炎細胞因子(如IL-1β，IL-6和MCP-1)的表達，這些細胞因子可以進一步誘導局部炎癥并阻礙胰島β細胞的正常功能[10]。有研究報道，炎性體不僅誘導細胞凋亡，還誘導細胞焦亡[11]。因此，抑制細胞凋亡和焦亡可以被認為是治療DM的潛在策略。

凋亡是基因調控的有序的細胞自發死亡方式，DM中胰島β細胞的凋亡可能是胰島素相對缺乏的主要機制。在DM的早期會出現高血糖胰島素抵抗和胰島β細胞肥大，隨著病情的發展，在T1DM和T2DM中都會出現胰腺功能障礙和胰島β細胞丟失，胰島β細胞的凋亡是T1DM發展的最后一步，致使胰島β細胞大量減少，并導致高血糖癥的發作[12]。高血糖癥中胰島細胞數量減小，其功能受損也逐漸加劇，而胰島細胞凋亡是其數量減小和功能受損加劇的基礎。因此，抑制胰島細胞凋亡來保護胰島細胞成為防止DM胰腺損傷的關鍵因素。而細胞凋亡主要由凋亡誘導基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2共同調控，Bax/Bcl-2相對表達失調促使下游 caspase信號通路激活，隨即引發凋亡，進而導致細胞功能受損。所以，抑制凋亡誘導基因Bax蛋白和caspase家族蛋白表達，以及促進凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達可為防治DM胰腺損傷發揮重要作用。本實驗結果表明糖尿病胰腺中凋亡蛋白Cleaved-Caspase3表達水平明顯升高，Bax/Bcl-2比例顯著升高，驗證高糖提升凋亡水平，而TLS治療可逆轉這一現象，說明TLS可以通過抑制凋亡對DM胰腺發揮保護作用。

細胞凋亡是生理性的死亡方式，而細胞焦亡有別于凋亡但在特征上又具有一定相似性，細胞焦亡是新型促炎的細胞程序性死亡方式。焦亡反應中Caspase-1可被上游炎性小體激活，并參與pro-IL-18/1β的活化和成熟，導致炎癥并誘導焦亡細胞膜孔形成，最終導致細胞死亡。進一步研究表明，DM和肥胖會加重胰腺炎的發展[13]，而胰腺炎與炎癥因子NALP3、TNF-α、IL-1β、IL-18等有關。NALP3炎性小體，通過與凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)相互作用來引發炎性小體的形成，ASC會募集并激活pro-caspase-1以產生活性的caspase-1，使pro-IL-1β/18分別轉化為成熟和具有生物活性的IL-1β/18，活性IL-1β/18將觸發一系列非細菌性炎癥反應和細胞焦亡[14]。本實驗結果表明，TLS治療可以有效降低DM小鼠胰腺中NALP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達，以改善焦亡水平，說明TLS還可以通過抑制焦亡對DM胰腺發揮保護作用。

綜上所述，DM可導致小鼠胰腺引發焦亡及凋亡水平增加，進而加重胰腺損傷。TLS可降低DM導致的胰腺組織焦亡水平，減少凋亡細胞的生成，為TLS在DM胰腺組織中產生保護作用提供新的研究視野及理論基礎。