人參皂苷Rg3增強PD-1抑制劑對彌漫大B細胞淋巴瘤免疫治療作用的體外研究

郭奕維，郭秀臣，張靜波，劉愛春，全麗娜

(哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院血液淋巴內科，黑龍江 哈爾濱 150081)

淋巴瘤是一種發病迅速的惡性腫瘤。彌漫大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是成人非霍奇金淋巴瘤(NHL)中最常見的一種類型，占全世界淋巴瘤病例的40%[1]。目前采用一線化療方案R-CHOP(利妥昔單抗、環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松)，DLBCL的預后得到很大改善。但仍有30%～40%的患者出現原發耐藥或復發而最終死亡[2]，這仍然是DLBCL診療中面臨的重要難題。

近年來，免疫治療作為一種新的有效治療手段備受關注，也為復發/難治惡性淋巴瘤的治療提供了新的思路。PD-1(CD279)是CD28家族成員，主要表達在活化的 T 淋巴細胞、B 淋巴細胞和巨噬細胞表面。PD-L1(programmed death 1 ligand 1)是PD-1的配體之一，正常情況下，兩者結合可產生多種免疫負調控作用，如抑制淋巴細胞功能，誘導活化的淋巴細胞凋亡，抑制免疫刺激性細胞因子釋放等[3-4]。細胞癌變后，多數腫瘤細胞膜上也表達PD-L1，其與PD-1結合后通過上述的免疫負調控機制，促進腫瘤免疫逃逸，從而減弱免疫系統對腫瘤的殺傷，使免疫功能紊亂和枯竭。而針對PD-1或PD-L1的單克隆抗體能夠阻斷兩者之間的結合，從而恢復T細胞功能。我們的前期研究證實，在DLBCL中PD-1表達增高，且通過抑制PD-1能夠增強T細胞對DLBCL的抗腫瘤作用[5]。

目前研究證實，中藥可通過多種途徑發揮抗腫瘤作用：誘導腫瘤細胞凋亡，抗腫瘤血管生成及抗轉移以及提高免疫功能[6-7]。人參是我國傳統的中草藥,研究人員己從人參中分離出40多種人參皂苷單體成分,其中,20(R)-人參皂苷Rg3抗腫瘤作用最顯著。目前研究發現人參皂苷Rg3抗腫瘤作用機制包括：(l)人參皂苷Rg3抑制腫瘤細胞增殖[8-11]；(2)人參皂苷Rg3促進腫瘤細胞凋亡[12]；(3)人參皂苷Rg3抑制腫瘤細胞侵襲和轉移[13-14]；(4)人參皂苷Rg3抑制腫瘤血管生成[15-16]；(5)人參皂苷Rg3逆轉腫瘤多藥耐藥[17-18]。

盡管現有研究證實人參皂苷Rg3對腫瘤細胞具有抑制增殖、促進凋亡、抑制侵襲轉移、抑制腫瘤血管生成、逆轉多藥耐藥等多重作用，但是其增強細胞免疫功能方面的研究寥寥，特別是在淋巴瘤免疫治療方面仍為空缺。本研究旨在探討應用人參皂苷Rg3聯合PD-1抑制劑對DLBCL的治療效果，觀察人參皂苷Rg3在增強T細胞對抗淋巴瘤治療中的作用及機制，為人參皂苷Rg3應用于淋巴瘤的治療提供理論基礎，并為臨床治療中擴大中藥聯合治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

超凈臺(ThermoFisher)；CO2培養孵箱(ThermoFisher)；CantoII流式細胞儀(美國BD公司)；倒置熒光顯微鏡(日本奧林帕斯)；Real-time PCR儀(美國ABI)；酶標儀(450，美國伯樂)；低速離心機(美國BeckmanCoulter)。

1.1.2 主要試劑

CD3磁珠購自德國美天旎公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑購自上海Roche公司;PHA試劑購自美國Sigma公司；流式熒光抗體CD3-PerCP、CD8-APC、CD4-FITC、PD-1-PE、CD19-APC購自美國BD公司；CFSE試劑購自日本Dojindo公司；溶血素購自美國BD公司；淋巴瘤細胞系SU-DHL4和OCI-LY-10由本實驗室保存；RPMI 1640細胞培養液，胎牛血清購自美國Gibco公司；IL-2及IFN-γ細胞因子檢測試劑盒購自美國Peprotech公司；Annexin-V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。人參皂苷Rg3購自吉林亞泰制藥股份有限公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶液配置成80mmol/L得儲備液。

1.2 方法

1.2.1 健康供者T細胞培養

采集健康供者外周血10 mL，經密度梯度離心，提取外周血單個核細胞(PBMC)，經CD3磁珠分選獲得T淋巴細胞，經腫瘤抗原刺激，體外激活并擴增T淋巴細胞。富集的T淋巴細胞(2×105)培養于RPMI完全培養基，加入PHA 48 h后，于96孔板中按10∶ 1的比例加入靶細胞進行共培養，每2天為細胞加入10 UI/mL的IL-2。

1.2.2 細胞系的培養

OCI-LY-10和SU-DHL-4細胞系的培養： OCI-Ly-10和SU-DHL-4細胞系分別為生發中心外亞型和生發中心內亞型。人彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株OCI-Ly-10，用含有10%人AB血清的IMDM培養液，加入1%青鏈霉素混合液，在37℃，5%CO2飽和濕度環境下孵育。SU-DHL-4細胞系，培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中。

1.2.3 MTT實驗

將對數生長期的OCI-Ly-10和SU-DHL-4細胞，重懸于新鮮生長培養液中，按照每孔105細胞量接種于96孔培養板，置于37℃，5%CO2培養箱中過夜，分別加入不同濃度的人參皂苷Rg3(3.25、6.5、12.5、25、50、100 μmol/L)處理24 h后,直接于每孔中加入MTT溶液20 μL，37℃，孵育4 h；室溫靜置至沉淀完全溶解(約10 min),用酶標儀在570 nm處檢測各孔OD值。實驗重復3組，每組取3個復空，取復孔平均值，計算細胞生長抑制率：(空白OD值-加藥組OD值/空白OD值)。

1.2.4 凋亡實驗

未標記CFSE淋巴瘤細胞用于凋亡實驗，按照每孔105細胞量接種于96孔培養板，3個實驗組分別加入IgG同型對照(A)，PD-1抑制劑(B)，人參皂苷Rg3聯合PD-1抑制劑(C)，72 h后收獲細胞標記Annexin V/PI，流式分析靶細胞凋亡，以AnnexinV+/PI-象限內細胞百分比定義為早期凋亡。實驗重復3組，每組取3個復空，取復孔平均值計算凋亡率。

1.2.5 培養液上清中細胞因子分析

收集異基因T細胞與靶細胞共培養72 h后的上清，具體分組同1.2.4，應用ELISA試劑盒檢測細胞因子IL-2和IFN-γ的濃度。設標準孔、待測樣品孔、空白孔。檢測時，酶標板設標準7孔，依次加100 μL不同濃度的標準品，空白孔加樣品稀釋液100 μL，余孔加待測樣品100 μL;37℃溫育2 h棄孔內液體，先后加入檢測A液和B液各100 μL，棄孔內液體再加底物溶液90 μL，加膜覆蓋37℃避光顯色，每孔加終止液50 μL。在酶標儀450 nm波長測量各孔A值(空白孔調零)，以標準品濃度值為橫坐標，以相應A值為縱坐標繪制標準曲線，求得標準曲線方程式，將樣本檢測A值代入方程式計算各指標濃度。

1.3 統計學分析

采用統計軟件GraphPad Prism 5對數據進行分析。數據顯示為均值±標準差，統計方法采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。P值<0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷Rg3對淋巴瘤細胞增殖的影響

檢測不同濃度的人參皂苷Rg3(3.25、6.5、12.5、25、50、100 μmol/L)對淋巴瘤細胞SU-DHL-4和OCI-Ly-10增殖的影響。發現隨著人參皂苷濃度的增加，細胞生長抑制的效應逐漸明顯，低、中濃度的人參皂苷Rg3(3.25、6.5、12.5、25 μmol/L)對淋巴瘤細胞增殖的抑制不明顯，而人參皂苷Rg3濃度為100 μmol/L時，淋巴瘤細胞的生長抑制率與50 μmol/L時差距不大，故選擇50 μmol/L作為最終的實驗濃度。

2.2 DLBCL細胞對T細胞增殖的影響

如表1所示，將標記CFSE的T淋巴細胞與兩種亞型的DLBCL細胞SU-DHL-4及OCI-Ly-10進行共培養，檢測T細胞增殖情況的變化，結果顯示與T淋巴細胞組(A)相比，T淋巴細胞+SU-DHL-4組(B)以及T淋巴細胞+OCI-Ly-10組(C)的增殖細胞[即CFSE(-)T淋巴細胞]百分比明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.01),證實DLBCL細胞可抑制T淋巴細胞增殖。

表1 DLBCL細胞(SU-DHL-4和OCI-Ly-10)對T細胞增殖的影響

注：與不加DLBCL細胞(A組)相比，△△P<0.01

2.3 PD-1抑制劑及人參皂苷Rg3對共培養體系T細胞增殖的影響

為進一步探討PD-1及人參皂苷Rg3對共培養體系T細胞增殖的影響，設置三組實驗：A:陰性對照組，B:PD-1抑制劑組和C:PD-1抑制劑聯合人參皂苷Rg3組，每組設置三個復孔，實驗重復三次，所得結果如表2所示。無論在生發中心亞型SU-DHL-4還是生發中心外亞型OCI-Ly-10中，PD-1抑制劑組的T細胞增殖率均高于陰性對照組，而PD-1抑制劑聯合人參皂苷Rg3組的T細胞增殖率是最高的，且較單獨加入PD-1抑制劑組有明顯差異(P<0.01)。說明PD-1抑制劑可部分恢復DLBCL細胞對T淋巴細胞的抑制作用，而且人參皂苷Rg3聯合PD-1抑制劑可進一步增強T淋巴細胞的存活。

表2 PD-1抑制劑聯合人參皂苷Rg3對T細胞增殖的影響

注：與PD-1抑制劑單藥組(B組)相比,**P<0.01

2.4 DLBCL細胞對T細胞凋亡的影響

將T淋巴細胞與DLBCL細胞(SU-DHL-4和OCI-Ly-10)共培養后，發現T淋巴細胞凋亡率增加，差異具有統計學意義(P<0.01，P<0.05),結果如表3所示。說明DLBCL細胞可促進T淋巴細胞凋亡。

表3 DLBCL細胞(SU-DHL-4和OCI-Ly-10)對T細胞凋亡的影響

注：與不加DLBCL細胞組(A組)相比，△△P<0.01，△P<0.05

2.5 PD-1抑制劑及人參皂苷Rg3對共培養體系T細胞凋亡的影響

實驗分組同前：A.陰性對照組，B.PD-1抑制劑組和C.PD-1抑制劑聯合人參皂苷Rg3組,檢測PD-1抑制劑及人參皂苷Rg3對共培養體系T細胞凋亡的影響，結果如表4所示。發現在兩種DLBCL的細胞系中，PD-1抑制劑組和PD-1抑制劑聯合人參皂苷Rg3組的T細胞凋亡率均低于陰性對照組，且以聯合用藥組更加顯著(P<0.05)。這說明在共培養體系中加入PD-1抑制劑可使T細胞的凋亡率下降，再加入人參皂苷Rg3可進一步降低T細胞凋亡。

表4 PD-1抑制劑聯合人參皂苷Rg3對T細胞凋亡的影響

注：與PD-1抑制劑單藥組(B組)相比,*P<0.05

2.6 PD-1抑制劑及人參皂苷Rg3對共培養體系細胞因子分泌的影響

上述三組，進一步檢測PD-1抑制劑及人參皂苷Rg3對共培養體系細胞因子分泌的影響，結果如表5、表6所示。我們發現在淋巴瘤細胞與T淋巴細胞的共培養體系中加入PD-1抑制劑可增加細胞因子IL-2和 IFN-γ的分泌，同時加入人參皂苷Rg3和PD-1抑制劑可進一步增加IL-2和 IFN-γ的分泌，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表5 PD-1抑制劑聯合人參皂苷Rg3對細胞因子IL-2分泌的影響

注：與PD-1抑制劑單藥組(B組)相比，*P<0.05

表6 PD-1抑制劑聯合人參皂苷Rg3對細胞因子IFN-γ分泌的影響

注：與PD-1抑制劑單藥組(B組)相比，*P<0.05

3 討論

手術、化療、放療是三大傳統的抗癌治療策略，近年來，免疫療法作為腫瘤治療的第四種方法，因具有明顯療效和高安全性逐漸受到關注，并被《Science》雜志列為2013年十大科學突破的首位[19]。免疫療法通過激活人體自身的免疫系統，識別并清除惡性腫瘤細胞，發揮抗腫瘤活性[20-21]。

PD-1是一種免疫共抑制分子，與其配體PD-L1或PD-L2結合，能夠抑制T淋巴細胞活化、成熟和增殖，促進凋亡，抑制細胞因子釋放等[20]。研究發現有一些淋巴瘤可通過PD-1配體的過表達誘導發生免疫逃逸，如經典型霍奇金淋巴瘤、原發縱隔B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤以及與EBV感染相關的淋巴瘤[22]，從而減弱免疫系統對腫瘤的殺傷，導致疾病進展。

2016年美國FDA批準PD-1抑制劑用于自體造血干細胞移植后復發或進展的經典型霍奇金淋巴瘤(cHL)，這也是PD-1抑制劑首次獲批應用于淋巴瘤的治療。此次批準是由于I期和II期試驗獲得較高的緩解率，其中總反應率(overall response rate, ORR)為65%～87%，完全緩解率(complete response rate, CR)為17%～22.4%[23-27]。迄今為止，已有兩種PD-1抑制劑，nivolumab和pembrolizumab加速批準應用于cHL。

但并非所有淋巴瘤患者都能從PD-1抑制劑中獲得如此好的療效，初期研究顯示PD-1抑制劑治療DLBCL的療效有限。Nivolumab單抗治療11例復發/難治DLBCL和10例其他類型B細胞淋巴瘤的I期研究顯示，客觀緩解率(objective response rate, ORR)為36%，2例CR(18%)，3例SD(27%)，而在其他類型B細胞淋巴瘤中未觀察到客觀緩解[28]。有研究顯示DLBCL患者中PD-L1的表達是不同的，EBV感染相關或是ABC亞型淋巴瘤的PD-L1水平更高[29-30]。而且DLBCL中PD-L1的表達與較差的整體生存是相關的，說明PD-L1是一個預示生存預后差的指標[30]。

我們的前期研究亦證實，PD-L1在間變大細胞淋巴瘤細胞、EBV+DLBCL細胞和非生發中心亞型(ABC)DLBCL細胞中表達，而在生發中心亞型(GCB)DLBCB中是陰性的，這與在DLBCL組織標本中獲得的結果是一致的。異基因T細胞與淋巴瘤細胞共培養，我們進一步發現淋巴瘤細胞能夠增加T細胞上PD-1的表達，抑制T細胞增殖，減少細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-10的分泌，通過阻斷PD-1，T細胞增殖和分泌細胞因子的能力在很大程度上得到恢復。而且，PD-1抑制劑對EBV+DLBCL的抗腫瘤免疫效果強于EBV-DLBCL，說明PD-1抑制劑對EBV+DLBCL更有效[5]。以上研究說明PD-1抑制劑應用于DLBCL可能涉及更復雜的分子機制，有待進一步研究。

人參是我國傳統的中草藥,研究人員己從人參中分離出40多種人參皂苷單體成分,其中,20(R)-人參皂苷Rg3抗腫瘤作用最顯著。王青就人參皂苷Rg3抗腫瘤作用及其機制研究作一綜述，其中指出人參皂苷Rg3在胃癌、肺癌、腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中發揮抗腫瘤活性，具體機制包括誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞侵襲和轉移，抑制腫瘤血管生成，逆轉腫瘤多藥耐藥，影響腫瘤信號傳導相關基因的表達，增強患者免疫能力等[31]。趙燕研究人參皂苷Rg3對鼻咽癌T輔助淋巴細胞I型(Th1)/T輔助淋巴細II型(Th2)細胞因子表達情況及臨床治療效果，發現人參皂苷Rg3可以改善鼻咽癌患者Th1/Th2細胞失衡，抑制腫瘤血管生成，提高放療效果，減輕放療毒副作用[32]。但在淋巴瘤中，關于人參皂苷Rg3調節細胞免疫功能方面的研究寥寥。

基于上述背景，本研究旨在探討人參皂苷Rg3聯合PD-1抑制劑對DLBCL的作用，通過體外實驗觀察人參皂苷Rg3在增強T細胞對抗淋巴瘤治療中的作用及其機制。研究結果發現，DLBCL細胞可抑制T細胞增殖，促進凋亡；聯合人參皂苷Rg3能夠增強PD-1抑制劑對恢復T細胞增殖，減少凋亡，并增加細胞因子IL-2和IFN-γ分泌的作用。

綜上，人參皂苷Rg3能夠增強PD-1抑制劑對DLBCL的抗腫瘤作用，其機制為增強T細胞分化增殖，抑制凋亡，增加細胞因子IL-2和IFN-γ分泌。這就為人參皂苷Rg3應用于淋巴瘤治療提供理論基礎，并為臨床治療中擴大中藥聯合治療提供實驗依據。