二硫化鉬負(fù)載呋喃西林協(xié)同抗菌研究

張瑤新馬隴豫馮 閃張 審劉超群

河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開(kāi)封475004

微生物種類主要包括細(xì)菌、真菌、病毒等，而有害細(xì)菌的傳播和發(fā)展更是嚴(yán)重威脅著人類的生命健康和打擾人類的日常生活［1］。抗菌材料是防止細(xì)菌的產(chǎn)生和蔓延最有效的方法之一［2］。目前的抗菌材料根據(jù)化學(xué)物質(zhì)內(nèi)部不同分為三種，包括天然、有機(jī)、和無(wú)機(jī)抗菌材料［3］。

二硫化鉬（MoS2）是一種常見(jiàn)的過(guò)渡金屬硫化物（TMD），是輝鉬礦的主要成分之一，呈黑色固體粉末，具有金屬光澤，屬于六方晶系或斜方晶系。MoS2的層狀結(jié)構(gòu)類似于“三明治夾心”，具體為一層鉬原子層夾在兩層硫原子層之間［4］。因其特殊層狀結(jié)構(gòu)，具備很多優(yōu)異的性能，如更好的吸附性能、更大的比表面積，優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)和細(xì)胞相容性。除此之外，MoS2的化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，耐高溫，不與大部分的橡膠制品和金屬發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，僅能被濃硫酸、濃硝酸等強(qiáng)氧化劑腐蝕，使MoS2在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域成為非常有前景的新型材料［5］。以MoS2為代表的一系列過(guò)渡金屬硫化物在近紅外區(qū)都具備很強(qiáng)的吸收效果，是非常好的光熱試劑，可以將光能轉(zhuǎn)化為熱能，利用光能轉(zhuǎn)化的熱能產(chǎn)生的高溫可以殺滅細(xì)菌。這一方法毒副作用較低且具有很好的區(qū)域選擇性。

呋喃西林（NFC）為一種淡黃色結(jié)晶性粉末，無(wú)臭，味初淡，略溶于水（1 ∶4 200）。屬于硝基呋喃類藥物，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有抗菌作用，是一種廣譜抗菌藥［6］。這類藥物主要通過(guò)干擾細(xì)菌體內(nèi)氧化酶系統(tǒng)和糖代謝過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)菌新陳代謝紊亂而死亡，從而達(dá)到殺菌的效果［7］。還可以預(yù)防和治療腸胃炎、球蟲(chóng)病等［8］。

根據(jù)文獻(xiàn)記載，光熱抗菌由于長(zhǎng)時(shí)間暴露在高功率的近紅外激光下，可能會(huì)導(dǎo)致皮膚的損傷，產(chǎn)生耐藥性等問(wèn)題，限制了這種材料在光熱治療抗菌的應(yīng)用。因此我們?cè)谔骄慷蚧f光熱抗菌的同時(shí)，在二硫化鉬表面負(fù)載一種藥物即呋喃西林，探究這種納米載藥復(fù)合物的協(xié)同光熱抗菌效果。

1 MoS2／NFC 納米載藥復(fù)合物的合成

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

鉬酸鈉（上海阿拉丁生化科技有限公司）；PEG?400（天津市石英廠壩縣化工分廠）；硫代乙酰胺（上海阿拉丁生化科技有限公司）；呋喃西林原料藥（上海阿拉丁生化科技有限公司，批號(hào)20140601）；呋喃西林對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）；磷酸二氫鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；磷酸氫二鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限有限責(zé)任公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海樹(shù)立儀器儀表有限公司）；激光粒度及Zeta 電位分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速離心機(jī)（湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)（優(yōu)尼柯（上海）儀器有限公司）；掃描電子顯微鏡（日本島津公司）；808 nm 紅外半導(dǎo)體激光器（寧波遠(yuǎn)明激光有限公司）；渦旋混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海市申安醫(yī)療器械廠）；雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（北京中心偉業(yè)有限公司）。

1.3 MoS2 的合成

取30 mg 鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）和60 mg 硫代乙酰胺（C2H5NS）于燒杯中，加20 mL PEG?400 水溶液（50%，v／v）（即10 mL 的水，10 mL 的PEG?400溶液），用玻璃棒攪拌均勻至溶解。在200 ℃下轉(zhuǎn)移到100 mL 聚苯內(nèi)襯不銹鋼高壓釜中24 h。結(jié)束后冷卻至室溫，打開(kāi)反應(yīng)釜，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入去離子水，于超聲波清洗儀器中搖晃超聲至均勻。放入8 000 r／min 的高速離心機(jī)中離心21 min，棄去上層清液，同樣方法反復(fù)洗滌3 次。放入50 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥6～10 h，即得到黑色的MoS2材料標(biāo)記為MoS2，在室溫下儲(chǔ)存。

1.4 MoS2／NFC 納米載藥復(fù)合物的合成

取2.864 g Na2HPO4·12H2O 和14.352 g NaH2PO4·2H2O，用900 mL 去離子水將其溶解，用pH 計(jì)調(diào)節(jié)pH 至5.3，再加入去離子水定容至1 000 mL，即得到磷酸緩沖溶液PB（pH 5.3），放置，備用。

取5 mg 呋喃西林粉末于離心管中，加1 mL PB（pH 5.3）溶液，超聲至完全溶解。取上文制得的3 mg MoS2于離心管中，超聲，混合均勻。用封口膜封住離心管口，放入搖床上搖24 h，至混合均勻，離心機(jī)8 000 r／min 離心21 min，取上清液于另一個(gè)EP管中標(biāo)記為上清液1，再加入PB（pH 5.3）溶液洗，離心，取上清液，記錄體積，標(biāo)記為上清液2，剩下沉淀部分放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥6～10 h，即得到二硫化鉬／呋喃西林納米載藥復(fù)合物，標(biāo)記為MoS2／NFC。

2 測(cè)試與表征

2.1 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察

選用上文制備好的MoS2用掃描電子顯微鏡來(lái)觀察MoS2的形貌表征。

2.2 電位和粒徑測(cè)定

選用激光粒度及Zeta 電位分析儀測(cè)量MoS2的電位和粒徑大小。樣品配制與測(cè)定：用鑰匙取適量干燥的MoS2于EP 管中，加入蒸餾水，置于超聲儀中使其分散均勻，放入激光粒度及Zeta 電位分析儀中，即可測(cè)量MoS2的電位和粒徑大小。

2.3 MoS2 的分散性試驗(yàn)

取適量的二硫化鉬配制一定濃度的溶液，靜置，并在7 d 后觀察溶液的變化，與之前做對(duì)比，觀察溶液的分散性變化。

2.4 紫外光譜圖測(cè)定

配制適當(dāng)濃度的NFC、MoS2觀察紫外特征吸收峰處吸光度值，同時(shí)配制適宜濃度的MoS2／NFC的濃度來(lái)觀察紫外特征吸收峰處吸光度值的變化。

2.5 紫外可見(jiàn)全波長(zhǎng)測(cè)定呋喃西林的吸附率

為了測(cè)定MoS2／NFC 材料表面的所含NFC 的量，首先對(duì)NFC 對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果表明，NFC 對(duì)照品溶液在375 nm 處有最大吸收峰。配制不同濃度的呋喃西林溶液，分別為0.002 mg／mL、0.005 mg／mL、0.008 mg／mL、0.011 mg／mL、0.014 mg／mL。然后，通過(guò)對(duì)不同濃度的NFC 對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描即可得到不同濃度的NFC 對(duì)照品溶液在200～700 nm 的紫外全波長(zhǎng)吸收數(shù)據(jù)。

以不同濃度的NFC 對(duì)照品溶液為橫坐標(biāo)，測(cè)得不同濃度的NFC 對(duì)照品溶液在375 nm 處的紫外特征吸收峰處吸光度值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式。根據(jù)方程式，得到不同濃度NFC 對(duì)照品溶液的吸光度值。

最后通過(guò)測(cè)定NFC 溶液和MoS2溶液反應(yīng)過(guò)后的復(fù)合材料，離心得到的上清液在375 nm 處的吸光度值，差量計(jì)算材料樣品表面的NFC 的含量，計(jì)算吸附率。

2.6 測(cè)試MoS2 的光熱性能

1）測(cè)試同一功率不同濃度條件下MoS2和MoS2／NFC 的光熱性能變化。配制不同濃度的MoS2溶液和MoS2／NFC。分別為0.25 mg／mL、0.35 mg／mL、0.4 mg／mL。采用808 nm 激光在1.5 W／cm2功率下照射不同濃度的MoS2溶液10 min，觀察10 min內(nèi)溫度的變化，每隔2 min 記錄下MoS2和MoS2／NFC 溶液的溫度變化，作出曲線圖進(jìn)行比較。

2）測(cè)試同一濃度不同功率條件下的MoS2和MoS2／NFC 光熱性能變化。用808 nm 激光功率強(qiáng)度分別為0.8 W／cm2、1.0 W／cm2、1.5 W／cm2，照射固定濃度為0.45 mg／mL 的MoS2和MoS2／NFC 溶液，觀察10 min 內(nèi)溫度的變化，每隔2 min 記錄下MoS2和MoS2／NFC 溶液的溫度變化，作出曲線圖進(jìn)行比較。

2.7 材料的抗菌活性測(cè)試

選用三種菌來(lái)進(jìn)行材料的抗菌性能測(cè)試，分別為以革蘭氏陽(yáng)性菌的S.aureus、革蘭氏陰性菌的E.coli、真菌類的C.albicans為三類菌代表測(cè)試復(fù)合材料對(duì)三種不同菌的抗菌活性。取3 個(gè)滅過(guò)菌的EP管配制MoS2、NFC、MoS2／NFC 各自為5 mg／mL 的母液，然后編號(hào)1～5 為MoS2組，6～10 為NFC 組，10～15 為MoS2／NFC 組。每組加入材料、PB（pH 5.3）、菌液，稀釋成濃度分別為0.25 mg／mL、0.35 mg／mL、0.45 mg／mL、0.5 mg／mL、0.6 mg／mL 的溶液，取100 μL 于固體培養(yǎng)基上，涂木棒涂抹均勻后，置37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12～18 h。觀察材料的抗菌效果，拍照記錄。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，觀察抗菌圖，通過(guò)對(duì)比菌的數(shù)量，觀察復(fù)合材料的抗菌性能變化。

3 結(jié)果與討論

3.1 掃描電子顯微鏡

MoS2的尺寸大小為400 nm，MoS2的形貌為規(guī)整的納米花狀球形結(jié)構(gòu)，且MoS2納米花表面褶皺明顯，顆粒大小均勻，且顆粒間隙比較明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 MoS2 的掃描電子顯微鏡圖

3.2 電位和粒徑

MoS2的電位值為－34.3 mV，表明二硫化鉬的表面帶負(fù)電荷，見(jiàn)圖2。MoS2平均粒徑大小為400 nm左右，與上文掃描電子顯微鏡測(cè)得的結(jié)果相符合，見(jiàn)圖3。

圖2 MoS2 的電位圖

圖3 MoS2 的粒徑

3.3 MoS2 的分散性試驗(yàn)分析

溶液的分散性沒(méi)有發(fā)生變化，表明溶液穩(wěn)定性良好。見(jiàn)圖4。

圖4 MoS2 溶液（a），靜置7 d 后的MoS2 溶液（b）

3.4 紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果分析

NFC 在450 nm 處具有吸收邊緣，MoS2在200～900 nm 內(nèi)都有較強(qiáng)的吸收，且MoS2／NFC 與NFC 相比在500 nm 以后有較大提高，表明呋喃西林的成功負(fù)載。見(jiàn)圖5。

圖5 MoS2／NFC 的紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果變化

3.5 紫外可見(jiàn)全波長(zhǎng)測(cè)定呋喃西林的吸附率

由NFC 的紫外可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描圖可知，NFC 在375 nm 處有最大吸收峰，見(jiàn)圖6。NFC 的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，將MoS2／NFC 溶液離心，取上清液并記錄體積，測(cè)量上清液的吸光度，代入以上標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可知道上清液的濃度，根據(jù)已知數(shù)據(jù)可得計(jì)算，呋喃西林的吸附率為15%，見(jiàn)圖7。

圖6 不同濃度的NFC 的紫外可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描圖

圖7 NFC 的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

3.6 MoS2 的光熱性能分析

1）測(cè)試同一功率條件下，不同MoS2和MoS2／NFC 濃度的光熱性能變化。見(jiàn)圖8、圖9。

2）測(cè)試同一濃度不同功率條件下的MoS2和MoS2／NFC 光熱性能變化。見(jiàn)圖10、圖11。

由圖8、圖9 可以看出，在同一功率下（1.5 W／cm2）的照射下，隨著MoS2和MoS2／NFC 溶液濃度的增大和照射時(shí)間的增加，材料溶液的溫度不斷上升。從圖10、圖11 可以看出，照射同一濃度（0.45 mg／mL）的MoS2和MoS2／NFC 溶液，隨著激光功率的增大和時(shí)間的增加，材料溶液的溫度逐漸升高，并在照射持續(xù)10 min 時(shí)，逐漸平緩，可得出MoS2有較好的光能轉(zhuǎn)化為熱能的性質(zhì)，有足夠殺菌的能力。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，通過(guò)對(duì)比圖8、圖9 MoS2和MoS2／NFC 在同一功率不同濃度條件下的溶液溫度變化圖與圖10、圖11 MoS2和MoS2／NFC 在同一濃度不同功率下溶液溫度變化圖，表明二者的溫度變化差異并不明顯。結(jié)果顯示，MoS2的光熱性能不會(huì)因表面負(fù)載抗生素呋喃西林（NFC）而受到影響。

圖8 同一功率不同濃度下MoS2 溶液的溫度變化圖

圖9 同一功率不同濃度下MoS2／NFC 溶液的溫度變化圖

圖10 同一濃度不同功率下MoS2 溶液的溫度變化

圖11 同一濃度不同功率下MoS2／NFC 溶液的溫度變化

3.7 材料的抗菌結(jié)果分析

材料MoS2在未光照條件下，E.coli的數(shù)量與空白菌液的數(shù)量相當(dāng)，幾乎長(zhǎng)滿了菌，而光照條件下剩下大約一半的菌，NFC 在光照或未光照條件下都?xì)⒘思s一半的菌，MoS2／NFC 在未光照條件下，大約剩下一半的菌，光照條件下，抑菌率在99%以上，此時(shí)MoS2／NFC的最小抑菌濃度為0.5 mg／mL。見(jiàn)圖12。

圖12 材料與E.coli 接觸后的抗菌效果

材料MoS2在未光照條件下，S.aureus的數(shù)量與空白菌液的數(shù)量相當(dāng)，幾乎長(zhǎng)滿了菌，而光照條件下剩下大約一半的菌，NFC 在光照或未光照條件下都?xì)⒘思s一半的菌，MoS2／NFC 在未光照條件下，大約剩下一半的菌，光照條件下，抑菌率在99%以上，此時(shí)MoS2／NFC 的最小抑菌濃度為0.4 mg／mL。見(jiàn)圖13。

圖13 材料與S.aureus 接觸后的抗菌效果

材料MoS2在未光照條件下，C.albicans的數(shù)量與空白菌液的數(shù)量相當(dāng)，幾乎長(zhǎng)滿了菌，而光照條件下剩下大約一半的菌，NFC 在光照或未光照條件下都?xì)⒘思s一半的菌，MoS2／NFC 在未光照條件下，大約剩下一半的菌，光照條件下，抑菌率在99%以上，此時(shí)MoS2／NFC 的最小抑菌濃度為0.35 mg／mL。見(jiàn)圖14。

圖14 材料與C.albicans 接觸后的抗菌效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MoS2只有在808 nm 近紅外激光照射下，才有較強(qiáng)的殺滅細(xì)菌的能力。光照對(duì)呋喃西林的抗菌效果無(wú)影響，復(fù)合材料有更優(yōu)異的協(xié)同抗菌作用，可以在較小濃度時(shí)的殺菌率達(dá)到99%以上。

4 討論

選用以鉬酸鈉為鉬源和硫代乙酰胺為硫源用低成本的水熱法制備出材料MoS2納米花，并利用MoS2納米花表面的孔狀結(jié)構(gòu)，有較大的吸附能力，可以成功將呋喃西林負(fù)載在MoS2上，制備出復(fù)合材料MoS2／NFC，這一合成方法生產(chǎn)成本低、安全環(huán)保、簡(jiǎn)便快速。

通過(guò)對(duì)革蘭氏陰性菌－大腸桿菌（E.coil）、革蘭氏陽(yáng)性菌－金黃色葡萄球菌（S.aureus）、真菌－白色念珠菌（C.albicans）的抗菌能力測(cè)試，復(fù)合材料MoS2／NFC 的抗菌能力明顯優(yōu)于單一材料MoS2和NFC，具有優(yōu)異的協(xié)同抗菌作用，可使抗菌材料在較少的用量下具有較高的殺菌率。

因此，該抗菌材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有了更廣闊的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。但現(xiàn)在的抗菌材料產(chǎn)業(yè)還不夠發(fā)達(dá)，需要我們更深入地研究和學(xué)習(xí)目前國(guó)際抗菌材料發(fā)展的各種經(jīng)驗(yàn)，爭(zhēng)取做到抗菌材料的進(jìn)一步發(fā)展。