細菌群體感應及其抑制劑的研究進展

馮 閃楊瑩瑩馬隴豫孫夢瑤劉超群

河南大學 藥學院，河南 開封475004

近幾十年中，細菌感染性疾病作為世界上最大的健康問題之一，引起了廣泛的關注。當前，用于細菌感染的最廣泛接受的治療方法是抗生素。但是，過量使用抗生素會增加細菌的抵抗力，降低治療效果，并導致高死亡率。在自然界中，細菌傾向于不可逆地附著在基質上，并生活在稱為生物膜的多細胞群落中，超過80%的細菌感染與生物膜有關。生物膜是由細胞外基質包裹、高度組織化表面吸附類細菌群體，包被有生物膜的細菌對傳統抗生素產生耐藥性，從而引發多種慢性和難治性感染疾病，例如耳部感染、細菌性心內膜炎、燒傷感染等。所以，消除生物膜的困難在各個領域中造成了重大問題，包括持續性感染、生物醫學植入物和設備、工業環境、海洋設備和食品包裝等領域。

細菌群體感應（Quorum sensing，QS）可以調控多種細菌的生理現象，例如生物膜的形成、毒素的產生、熒光的產生等。首次提出群體感應是在20 世紀60 年代末和70 年代初，當時研究人員發現肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）的遺傳能力和兩種海洋細菌的發光能力需要細胞外分子的產生［1?2］。然后，通過這些分子的細胞信號被認為是化學交流的一種形式，但是這些早期發表的作品受到質疑，通常被忽略。后來，對費氏弧菌發光機理的研究發現其光密度與細菌濃度呈比例相關性［3］。自20 世紀90 年代以來，群體感應研究的數量不斷增加，研究領域也顯著多樣化，通過對多種不同細菌進行分析，發現在這些細菌中都存在信息交流現象。1994 年，Fuqua 等［4］提出群體感應，分析綠膿桿菌、費氏弧菌及哈維氏弧菌產生的信號分子、生物功能。研究發現，群體感應具有誘導生物膜的形成、調控生物發光、激活毒力途徑等多種功能。破壞群體感應途徑的化學物質被稱為群體感應抑制劑（Quorum Sensing Inhibitors，QSIs），目前已經對群體感應抑制劑進行了廣泛的研究，其既不會影響細菌的生長，也可以抑制生物膜的形成和成熟，并且作為抗生素的促進劑，降低毒力因子的含量減弱微生物的毒性，成為新型抗毒藥物靶點和抗菌策略的代替方法。

本文在前人的基礎上，首先對群體感應的概念和分類進行簡單介紹，并且系統性總結群體感應抑制劑的機制、分類和主要應用，可提供新型廣泛應用的安全藥物替代品的開發策略。

1 群體感應系統

群體感應是一種細胞間的通信途徑，使細菌群體根據細胞密度協調重新編程基因表達。簡單地說，在所有的群體感應系統中，都產生一個稱為自誘導物質（Auto?inducer，AI）的信號分子，并分泌（或自由擴散）到周圍環境中。隨著細菌數量的增長，信號分子的濃度也在增加，直到達到一個閾值濃度，在這個濃度上，它與一個同源受體蛋白結合并激活之。通過群體感應感受器感知到的群體感應信號分子在群體中的所有成員中觸發了生理反應，例如毒素、抗生素和熒光的產生，包括形成適應環境變化的生物膜［5?6］等，最終在整個群體中重新編程基因表達。

每種菌體群體感應都有不同的信號分子來調節基因表達。根據群體感應信號的不同分子，群體感應分為以下幾種類型［7］：①以酰基高絲氨酸內酯類分子（Acyl?homoserine lactones，AHLs）作為AI 的革蘭氏陰性菌的群體感應系統；②以寡肽類分子（Au?toinducing peptide，AIP）作為AI 的革蘭氏陽性菌的群體感應系統；③以呋喃酰硼酸二酯類分子（AI?2）作為種間細菌交流AI 的群體感應系統，其在多數革蘭氏陰性菌和陽性菌中都存在；④以應激激素腎上腺素和去甲腎上腺素AI?3 作為種間細菌交流AI 的群體感應系統；⑤其他類型的群體感應系統。下面就按照上述不同類型分別進行介紹。

1.1 以AHLs 作為AI 的革蘭氏陰性細菌的群體感應系統

作為群體感應的自誘導劑，AHLs 是一種特殊的小分子水溶性化合物，在革蘭氏陰性菌的群體感應中起關鍵作用，并且是由革蘭氏陰性菌產生的信號分子。LuxI 是一種細胞內蛋白酶，可以催化AI 的合成。LuxI 蛋白酶催化載體蛋白的酰基側鏈與酰基和S?腺苷甲硫氨酸上的高絲氨酸結合形成AHLs［8］，AHLs 可以自由進入和離開細胞。當細菌密度增加時，AHLs 積累到一定濃度閾值時，它們結合到LuxR 蛋白的氨基殘基上，成為細胞質中的受體，從而激活調控的基因表達［9］。例如，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有兩個群體感應系統LasR／LasI 體系和RhlR／RhlI 體系，分別調節信號分子3?oxo?C12?HSL 和C4?HSL 的合成，化學信號層次化排列，RhlR 由LasR 調節。前者LasR／LasI 系統中的AHLs 信號分子可與LasR 結合以激活轉錄，增加了外毒素A、堿性蛋白酶和彈性蛋白酶的基因表達；后者RhlR／RhlI 體系中的AHLs 信號分子可以與RhlR 受體結合，以調節大量基因的表達，如鼠李糖脂溶素、氰化物、殼多糖酶和綠膿素等物質［10］。

1.2 以AIP 作為AI 的革蘭氏陽性菌的群體感應系統

在革蘭氏陽性菌中，許多線性和翻譯后修飾的肽基群體感應信號分子與DNA 攝取和加工、偶聯和毒力相關。AIP 通過典型的核糖體合成表達為無活性的前肽，隨后經過處理和修飾產生活性群體感應信號，其隨著細菌濃度的增加，當到達一定濃度閾值的時候，位于細胞膜上的AIP 信號識別系統與之相互作用，最終發揮調節作用［11］。因為AIP 不能在細胞膜間自由擴散，受體細胞對AIP 的感知通常是由傳感器激酶介導的，它通過磷酸化級聯將信號從細胞膜轉移到細胞內的同源反應調節因子［12］。例如金黃色葡萄球菌（Staphylo?coccus aureus）中的短肽分子Agr，不能進入微生物細胞，而是通過與膜受體結合啟動信號傳輸，磷酸化的AgrA 與轉錄因子SarA 相關，間接激活編碼合成毒性因子的基因轉錄，AgrA 還可以激活靶啟動子，上調分泌的毒力因子，下調參與宿主細胞粘附和生物膜形成的表面蛋白［13］。

1.3 以AI?2 作為種間細菌交流AI 的群體感應系統

雖然上面描述的AHLs 和AIP 只局限于一個相對狹窄的細菌種類，但有跡象表明一種常見的細菌信號分子。AI?2 種間交流群體感應系統，與AHLs首次在發光的海洋生物哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）中被識別。在AI?2 介導的種間交流群體感應中，細菌可以通過AI?2 感知周圍細菌的存在，并調節自身行為［14?15］。AI?2 是可擴散的信號分子，一種呋喃氧基硼酸二酯分子，由于在其結構中存在硼而獨特，通過復雜的磷接力級聯激活哈維弧菌的生物發光，中間產生LuxLM 合成的AI?1（AHLs 類）和由LuxS 合成AI?2［13］，當AI?2 達到一定濃度時，它進入細胞并在磷酸激酶LsrK 的作用下被磷酸化，形成信號分子，以調節群體感應相關基因的表達［8］。所以AI?2已被證明在許多不同的革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌、螺桿菌、卟啉單胞菌）和革蘭氏陽性菌（如釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌）中，暗示著可能有一個普遍的細菌群體感應的信號分子。

1.4 以AI?3 作為種間細菌交流AI 的群體感應系統

以AI?3 作為種間細菌交流AI 的信號分子來源于人類應激激素腎上腺素和正腎上腺素，其調控過程非常復雜［16］。存在于部分革蘭氏陰性菌，如腸道共生菌、出血性大腸桿菌、大腸埃希氏菌和痢疾桿菌（Shigella dysenteriae）［17］。

1.5 其他類型的群體感應系統

當然還存在一些其他類型的群體感應系統，例如真菌群體感應系統、CAI?1 型群體感應系統、DSF調控的群體感應系統和喹諾酮類群體感應系統（信號分子PQS 和HHQ）［10］。Hornby 等［18］鑒定了調節白色念珠菌形態轉變的關鍵AI 信號分子是金合歡醇。從霍亂弧菌和哈維弧菌發現信號分子CAI?1。野油菜黃單胞桿菌（Xanthomonas campestris）可產生一種稱作DSF 的信號分子［19］，可以參與多種毒力因子、生物膜形成，細胞外多糖，鐵吸收，細胞外酶產生的調節［10?20］。銅綠假單胞菌也存在一種新的分子喹諾酮信號，提供了RhlR 和LasR 之間的連接，所以喹諾酮類群體感應系統是銅綠假單胞菌所特有的信號系統［10］。

2 群體感應抑制劑

2.1 群體感應抑制劑的機制

影響AI 及其受體蛋白積累或識別的過程會破壞群體感應，因此群體感應抑制劑的作用機理主要分為以下四種類型：①降解信號分子，使其不能與受體蛋白結合，例如枯草芽孢桿菌所產生的AiiA 酶；②抑制AI 的生成，例如三氯生、鄰苯三酚、硼酸和砜類化合物；③合成一些AI 的結構類似物，與相應的受體蛋白競爭性結合，例如海洋紅藻、呋喃酮?56、呋喃酮C?3O；④降低AHLs 同源受體蛋白或AHLs 合成酶的活性，例如AHL?酰基轉移酶、AHL?內酯酶、AHL?氧化還原酶。

2.2 群體感應抑制劑的分類

根據其來源，分為兩種：天然產物群體感應抑制劑和人工化學合成群體感應抑制劑［21］。下面分別舉例進行簡單介紹。

2.2.1 天然產物群體感應抑制劑

群體感應抑制劑是由多種生物產生，例如來自陸地、海洋或淡水生態系統的植物、微生物、動物和真菌等。

1）植物類群體感應抑制劑。目前，文獻報道許多植物可以產生抑制群體感應的活性物質，例如淡水和海洋微藻還有衍生自海洋紅藻（Delisea pul?chra）的鹵代呋喃酮類化合物，可以抑制哈氏弧菌的生物熒光的產生［22］。當然具有抑制群體感應活性的天然產物還包括從假單胞菌中分離提取出來的姜黃素（curcumin）、兒茶素、肉桂醛、原氨茶素。Thim?maraju 等［23］研究證明，姜黃素可以抑制銅綠假單胞菌中毒力因子的基因表達，并影響生物膜的成熟、細菌群游和胞外多糖的產生，同時還可以增強病原菌對抗生素的耐受性［24］，被認為是一種新型抗毒藥物靶點。哈維氏弧菌BB120 和大腸桿菌O157：H7 菌株的生物膜可以分別被槲皮素和柚皮素抑制［25］。食物大蒜提取物是含AHLs 依賴性群體感應抑制劑。針對銅綠假單胞菌感染的囊性纖維化患者的臨床實驗發現，口服大蒜提取物有改善的趨勢，阿焦烯就是從大蒜中提取出來的抑制劑，可在小鼠肺部感染模型中促進銅綠假單胞菌的清除并增強妥布霉素存在時對生物膜的殺傷能力，有效抑制鼠李糖脂等毒力因子的產生［26］。群體感應抑制劑可以從所有類型的植物組織中提取，包括根和根狀莖、花、樹皮、葉子、莖、種子和果實等。Musthafa 等［27］證明了人參、香蕉、菠蘿等水提物也可以抑制細菌的群體感應。植物生物堿角氨酸，一種從發芽大麥中提取的膳食酚類植物化學物質，傳統上被用作血管收縮和間接作用腎上腺素能劑。通過對其研究發現可作為一種新型天然群體感應抑制劑，抗生物膜劑，氨基糖苷類抗生素促進劑，以對抗銅綠假單胞菌。

2）微生物類群體感應抑制劑。微生物類群體感應抑制劑主要包括各種群體感應猝滅酶和次級代謝產物［21］。群體感應淬滅酶的三種類型，即AHL?酰基轉移酶，AHL?內酰胺酶和AHL?氧化還原酶，可以破壞AHLs，從而使信號分子失活［28］。微生物的次生代謝產物因其不同的代謝方法而各不相同。群體感應抑制劑分子在芽孢桿菌、嗜硫桿菌和假單胞菌等不同屬中都有報道，然而只有少數微生物類群體感應抑制劑已被很好地鑒定。例如環（L?脯氨酸?L?苯丙氨酸）、環（L?脯氨酸?L?異亮氨酸）或者環（L?脯氨酸?L?亮氨酸）可以抑制生物熒光的產生［29］。黏質沙雷氏菌（Serratia plymuthica）和耐熱熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）會產生不尋常的抑制劑，即揮發性有機化合物VOC，如二甲基二硫化物［10］，抑制以AHLs 為基礎的群體感應調節。

3）動物類群體感應抑制劑。Yang 等［30］嘗試用AiiA 特異性抗血清中和AiiA 酶時，偶然發現抗AiiA血清對3?oxo?C12?HSL 有較強的滅活活性，因為3?oxo?C12?HSL 在細菌毒力基因表達的群體感應調節中發揮重要作用，所以首次發現來自6 種哺乳動物的血清樣品可以對一系列AHLs 信號顯示出強烈的酶降解活性。研究發現，在已知的產生群體感應抑制劑的動物中，大部分屬于海洋生態系統，Junguk等［31］發現火蟻（Solenopsis invicta）能夠產生有效的生物群體感應抑制劑，其體內的生物堿可阻斷群體感應。最常見的海洋群體感應抑制劑產生者是軟珊瑚和海綿（Ircinia felix），但柳珊瑚、硬珊瑚、海洋苔蘚蟲（Flustra foliacea）和腹水蟲也產生群體感應抑制劑。例如海綿中提取的呋喃三萜化合物在革蘭氏陰性菌中起抑制生物膜的作用［21］、Peters 等［32］發現海洋苔蘚蟲產生不同的溴化生物堿，其阻斷AHLs調控基因表達的能力在不同的細菌中已被證明。包括生活中的肉類或肉類副產品冷凍魚、雞胸、牛肉等提取物［33］、家禽肉類提取物中脂肪酸類化合物也被認為是群體感應抑制劑的意外來源。

4）真菌類群體感應抑制劑。研究發現，子囊菌青霉屬產生的群體感應抑制劑，如青霉素或青霉素酸，其中含有呋喃酮核心，可以靶向RhlR 和LasR 蛋白。例如在海洋真菌（Penicillium sp.QF046）代謝物中發現的星形曲霉毒素可以有效抑制紫色桿菌的群體感應［16］。一些擔子菌，如食用銀耳、黑木耳（Au?ricularia auricular）提取物、黃孢或者藥用真菌桑黃（Phellinus igniariu）提取物，也可產生群體感應抑制劑［34?36］。

2.2.2 人工化學合成群體感應抑制劑

基于藥物設計，即信號或信號前體類似物的化學合成，或先前識別的群體感應抑制劑類似物的化學合成，通過這些仿生方法，大量的分子被發現。根據它們的不同結構，人工化學合成的群體感應抑制劑分為呋喃酮類、內酯類和取代的HSL 類等。其中，化學合成的呋喃酮類化合物研究相對廣泛，例如He Z 等［37］發現的呋喃酮C?30，可以作細菌群體感應信號分子的拮抗劑。Joseph 等［38］研究發現信號分子AHLs（OdDHL）是由Lux 型酶生物合成，而這些AHLs 信號被細胞內的LuxR 型受體感知，它們結合信號后通常形成活性二聚體，作為轉錄因子誘導群體感應調控基因的表達。Reverchon S 等［39］合成的22 種新型AHLs 類似物，分別在酰基鏈的C?4 位上有衍生物、環烷基或芳基取代基，可以競爭性抑制天然誘導劑活性的能力。Morkunas 等［40］發現銅綠假單胞菌可以產生一系列的毒力因子，增強其破壞宿主組織并導致疾病的能力，其中最重要的毒力因子是花青素。但是通過一種稱為群體感應的細胞間通訊機制可以調節花青素的產生，他們合成的非生物OdDHL 模擬物，能夠與內源OdDHL 競爭的新化合物，從而抑制花青素的產生。Roy 等［41］開發了AI?2 信號分子的C?1 烷基類似物，該類似物與AI?2一樣，被細菌激酶LsrK 激活，并通過轉錄調節因子LsrR 調節AI?2 特異性基因轉錄，同時抑制多種細菌的群體感應響應。研究發現［42］，針對AI?2 合成的LuxS 蛋白，會導致信號通路的缺陷，在控制多種病原體方面更為有效。例如鹵代呋喃，對AI?2 群體感應有直接的抑制作用，增加體外產生AI?2 的濃度對生物膜密度有負面影響。

2.2.3 細菌群體感應淬滅酶

群體淬滅是在群體感應需要信號分泌、識別、信號?受體復合體形成等任一過程中被干擾而影響甚至阻斷群體感應［43］。群體感應調控的基因與細菌致病性、致腐性等性狀相關，所以任一過程都需要有序并且高效地完成。研究開發的兩種信號分子類似物：環孢菌素A 與伐司樸達都可以通過阻止Rgg2的激活、促 進Rgg3 的 抑制，來干擾生物膜形成［43?44］。Persson 等［45］合成了一些小系列的構象限制類似物，其中基于硫化物AHLs 被接枝到一個二硫烷基上，比大蒜衍生的結構更加靈活有效，還可以通過對酰基鏈的修飾，可以與HSL 競爭受體結合位點，實現群體淬滅。Takaya 等［46］研究發現Lon 蛋白酶是一個強大的負調控因子，通過降解特定的底物來調節細胞系統，其中就包括群體感應系統。

3 群體感應抑制劑的應用

3.1 新型抗菌策略

抑制群體感應是控制細菌生長和致病的有效替代策略。干擾一個菌群的群體感應可以控制致病細菌的過度生長，而不會對細菌遺傳造成過大的選擇性壓力，從而導致耐藥突變體的產生。群體感應抑制劑可以通過增加生物膜中的細菌敏感性或者增加感染后的宿主存活率來提高抗生素治療的成功率［47］。例如Sun 等［48］合成的多種藥物傳遞的氮化碳空心球，通過群體感應抑制劑、抗生素和光動力治療聯合抗菌，然而群體感應抑制劑作為單一治療在人類治療上的應用，似乎不如在其上使用抗生素或抗生素加生物膜分散劑的綜合治療策略。V2O5納米線作為一種催化劑材料，具有類似過氧化物酶的活性，可以催化過氧化氫和鹵離子生成次鹵酸和單線態氧，其中次鹵酸可以鹵化信號分子，干擾信號分子的產生破壞群體感應，阻止生物膜的形成［49］。

3.2 植物源生物防治劑

研究表明，植物源的群體感應抑制劑在不抑制細菌生長的情況下能夠抑制細菌的群體感應，來降低病原菌的致病性，具有不易誘導細菌耐藥性又可以起到防治細菌病害的優點［50］。例如香樟（Cinna?momum camphora）制備的精油可抑制大腸桿菌、紫色桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞桿菌的活性，是基于細菌群體感應抑制作用的新型抗菌物質，其制備方法簡單可靠，并且抑菌劑具有對細菌不產生耐藥性和無毒害作用等優點和特點。因此，以細菌群體感應為靶標的植物源生物防治劑的研發已成為熱點。

3.3 水產養殖

隨著水產養殖的集約化，生態和動物健康問題出現，其中細菌性疾病是商業水產養殖中最嚴重的問題之一。弧菌病通過藻類、輪蟲和用于飼養的青蒿菌傳播，在幾乎任何種類的水產養殖生物中都有很高的死亡率。通過具有信號分子降解活性的群體感應抑制劑處理從而增加水產品的產量［51］。20 世紀初Defoirdt 等［52?53］證明了天然人工合成的溴化呋喃酮可以通過破壞以AI?2 基礎的病原菌群體感應來保護鹵蝦（Artemia franciscana），但其對高等生物可能具有毒性。研究發現從歐洲黑鱸（Dicentrarchus Labrax）和亞洲黑鱸（Lates calcarifer）中可以分離出具有兩種不同的AHLs 降解富集培養基（ECs）混合物，由于弧菌的毒力是由AHLs 依賴的群體感應系統介導的，所以這些新型ECs 混合物在水產養殖系統中起群體感應猝滅作用［54］。

3.4 新型食品防腐劑

每年，由于糧食腐敗造成的經濟損失非常嚴重。新鮮食物的腐敗主要是由微生物活動引起的。因此，開發新的防腐劑和開發防止腐蝕的新方法已成為關注的焦點［55］。由于群體感應在食品腐壞和細菌致病過程中起著至關重要的作用，因此干擾群體感應系統可能是防止食品腐壞和人類感染的有效策略。例如從商業魚類，綦國紅等［55］分離出的三種假單胞菌可產生AHLs，并通過群體感應調節細菌腐敗特征的表達。AHLs 的水平與腐敗細菌的數量相關［56］，在由革蘭氏陰性菌變質引起的食物腐敗中檢測到AHLs，發現當變質細菌達到一定數量時，將檢測到AHLs。因此，安全穩定的群體感應抑制劑將為解決食品變質，延長食品保質期，確保食品安全提供新途徑。

3.5 污水處理

為了使膜生物反應器（Membrane bioreactor，MBR）的廢水處理具有可持續的性能，探索新型的生物群體感應抑制劑來控制膜生物淤積是非常有價值的。在最近的研究中，群體感應抑制劑為控制膜生物污染提供了替代途徑。例如甜菜提取物（PBE）作為群體感應抑制劑，可以通過抑制AI 信號分子的生成來減緩膜生物淤積［57］，可能成為一種新的靶向AI 控制膜生物污染的藥劑。

3.6 其他應用

有研究證實共價結合的群體感應抑制劑二氫吡咯酮（DHPs）對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌均有降低黏附的作用［58］，表面固定化抗菌DHPs 在體外48 小時可以減少細菌粘附和生物膜的形成。因此，基于加入群體感應抑制劑的策略是預防設備相關性感染的一種潛在方法。還有文獻報道一種新的AHLs 降解蛋白，稱為AidH，可以水解AHLs 的高絲氨酸內酯環的酯鍵，顯著降低假單胞菌生物膜的形成和果膠桿菌的致病性，表明該酶能夠通過降解AHLs 有效地抑制這些細菌的群體感應依賴功能［59］。所以AHLs 酶促失活的群體猝滅在預防和治療感染方面有很大的前景。

4 結語

目前，細菌群體感應在遺傳學、生物化學、基因調控等方面都有很大的進步。通過對群體感應系統的研究，我們發現多種菌屬存在大量的群體感應信號分子和調控功能，擴展了群體感應信號分子的生物學功能，同時也促進了新概念和術語的出現和傳播，如群體猝滅、抗病毒作用、擴散感知、質量轉移和社會微生物學。

隨著多種抗生素耐藥菌株的出現，群體感應的抑制提供了一些有趣的可能性來減少耐藥出現的選擇壓力，被認為是一種很有前途的新型抗毒藥物靶點。所以，基于群體感應抑制劑的治療是一種有吸引力的策略來抑制細菌生物膜的形成而不引起過度的抗生素耐藥性，很大程度上是由于對植物化學物質和抗生素的替代或補充方法的需要，這種相對新穎的抗菌機制使其在開發新型抗細菌感染藥物方面有很大潛力。然而，在抑制群體感應方面，仍然有許多問題有待解決，例如分子或者酶的靶向和傳遞、評估細胞毒性、群體感應抑制劑在體內體外的不良影響等。盡管有相對豐富的數據和相關的專利，但抑制群體感應策略并沒有廣泛應用于創新產品，如海洋工業的防污漆。雖然許多生物或組織提取物表現出抑制群體感應活性，但僅在少數情況下才對活性化合物進行了充分表征。因此，未來有必要對相對復雜系統中關鍵種群體感應及各個群體感應通路間的關系進行研究。