達沙替尼衍生物的合成及其產率分析

王延玲袁 琦蒲曉輝

河南大學 藥物研究所，河南 開封475004

基于在臨床試驗中獲得的有效數據，達沙替尼（DAS）于2006 年被FDA 批準用于治療BCR?ABL依賴的慢性髓系白血病或費城染色體陽性的對伊馬替尼治療有抗藥性或不耐受的成人急性淋巴細胞白血病［1?3］。

腫瘤治療的一個新興領域是針對腫瘤微環境，而DAS 是一種強效的BCR?ABL 激酶抑制劑，在0.6～0.8 mmol 的濃度下仍然可以發揮作用。并且DAS可干擾與血管生成和人類癌細胞轉移級聯有關的關鍵細胞功能，如運動和侵襲。DAS 通過直接影響血管內皮細胞和抑制某些腫瘤細胞的促血管生成信號，降低了微血管內皮細胞在體外形成血管的能力，以及腫瘤細胞誘導周圍的血管生成能力，從而抑制腫瘤生長［4?6］。

由于DAS 獨特的抗癌機制和低毒性，已成為治療慢性粒細胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）的最佳藥物。除此之外，DAS 在治療各種癌癥中，如白血病、肺癌、前列腺癌和卵巢癌，也取得了令人鼓舞的結果［7?9］。然而，DAS 的極低溶解性導致其應用受限，且有試驗表明，DAS 雖未發現耐藥性，但在使用過程中依然存在胸膜積液、發熱、血小板減少、心臟衰竭，呼吸困難等不良反應［10?12］。因此，對DAS 進行適當的修飾，可以改善其溶解性，最大限度地降低全身毒性，從而提高治療效率。因此，本研究利用DAS 上的羥基與丁二酸酐（SA）開環后的羧基進行酯化反應，制備帶有游離羧基的達沙替尼丁二酸單酯衍生物（DAS－SA），并采用高效液相色譜法（HPLC）來間接測定產物中的DAS?SA。根據標準曲線法計算產物中DAS?SA 的百分含量，并對該反應的產率進行計算，同時為后期深入研究DAS 的衍生物的含量測定提供方法依據，也為進一步修飾DAS 以改善其理化性質和成藥性奠定基礎。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

磁力攪拌器（上海力辰科技有限公司），紫外可見分光光度計（UV?2600，日本島津公司），Waters2695?2489 型高效液相色譜儀（沃特世科技上海有限公司），分析天平（BSA224S，德國Sartorius）。

1.2 試劑

達沙替尼原料藥（DAS，批號181015，南京德爾諾醫藥科技有限公司）；達沙替尼對照品（批號420041?201601，純度97%，中國食品藥品檢定研究院）；丁二酸酐（SA，批號20180129，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（批號600722?07813，色譜純，天津市四有精細化學品有限公司）；乙腈（批號20180131，色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，批號20191005，分析純，天津市德恩化學試劑有限公司）；N，N?二甲基甲酰胺（DMF，批號20180108，徐州天鴻化工有限公司）。水為哇哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 達沙替尼丁二酸單酯衍生物的合成

DAS 0.1 mmol，SA 0.5 mmol，置于三頸瓶中加入3 mL DMF 在N2氣中攪拌溶解。然后加入1 mL 三乙胺，在N2氣中繼續反應48 h（25 ℃，500 r／min）。反應結束后，將反應液旋至糖稀狀，用CH2Cl2和CH3OH 洗滌，離心得到沉淀，真空干燥即得DAS?SA。

2.2 衍生物的核磁共振氫譜（1H NMR）表征

將適量（10～20 mg）的待測樣品溶解于氘代二甲基亞砜（DMSO?d6）中，以四甲基硅烷（TMS）作內標，在室溫下，用核磁共振儀測定其核磁共振氫譜（1H NMR）。

SA、DAS 及DAS?SA 的1H NMR 圖所示，在SA 圖譜中δ＝3.01×10－6處為SA 中亞甲基（－CH2）的化學位移。在DAS 圖譜中，δ＝7.17、7.53×10－6處為DAS 苯環上的質子峰，δ＝8.47、10.21×10－6，為DAS 上b、c（－NH－）的質子峰，a處為DAS 上羥基中的質子的化學位移。在DAS?SA 的圖譜中d、e處原DAS 苯環上的質子峰以及b、c處－NH－的質子峰均存在，a 處Das 上的－OH 質子峰消失，且在δ＝2.81、2.74×10－6出現新的－CH2－CH2－上的質子峰，因此可以認為DAS?SA 被成功合成。

2.3 檢測波長的選擇

稱取DAS 對照品適量，用甲醇稀釋成濃度適宜的樣品，作為供試液。以甲醇溶液作為空白溶劑，在200～600 nm 波長范圍內進行紫外掃描，考察其紫外吸收情況，結果見圖1。

圖1 DAS 的紫外波長掃描

由圖1 可知，DAS 在322 nm 處有最強吸收。因此，選擇322 nm 作為DAS 的檢測波長。

2.4 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.3%磷酸鹽緩沖液?乙腈（70 ∶30）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：322 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.5 系統適用性試驗

取DAS 對照品適量，用甲醇溶解后稀釋至適宜濃度，得到DAS 對照品溶液，將DAS 對照品溶液注入高效液相色譜儀，按照2.2 項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖2。

如圖2 所示，在2.2 的色譜條件下，DAS 色譜峰呈正態分布且有較好的對稱性，并且理論塔板數為5 289＞3 000、分離度為1.857，＞1.5，符合藥典規定。

圖2 DAS 的高效液相色譜圖

2.6 專屬性試驗

按上述反應條件下的比例取DAS（反應物），SA（反應物）以及三乙胺（反應催化劑），加入適量DMF（反應溶劑）溶解后，用甲醇稀釋至適宜濃度，制備混合對照品溶液。按照上述混合對照品溶液的制備方法，制備不含DAS 的陰性對照品溶液。另取合成產物適量加入少量DMSO 溶解后，用甲醇稀釋成適宜濃度的樣品得到DAS?SA 溶液。將DAS 對照品溶液、混合對照品溶液、陰性對照品溶液及DAS?SA 溶液分別注入高效液相色譜儀，按照2.2 項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。見圖3、圖4、圖5。

圖3 陰性對照品溶液的高效液相色譜圖

圖4 混合對照品溶液的高效液相色譜圖

圖5 DAS?SA 的HPLC 圖譜

陰性對照色譜與對照品溶液色譜相同保留時間處無干擾峰，且混合對照品及DAS?AS 色譜圖中DAS 峰與其他雜質峰及DAS?SA 的色譜峰均分離較好，表明方法專屬性強，能滿足檢測要求。

2.7 線性關系考察

精密稱取DAS 對照品10 mg，置于100 mL 容量瓶中，先用少量甲醇溶解，再用甲醇定量稀釋至刻度線，搖勻，即得100 μg·mL－1DAS 對照品貯備液。用移液管精密量取10 mL 的100 μg·mL－1DAS 對照品溶液，置于50 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到20 μg·mL－1DAS 對照品溶液作為母液。再將母液分別稀釋成濃度為0.5、1.0、5.0、10、15、20 μg·mL－1的溶液，按照2.2 項下的色譜條件進樣，記錄相應的峰面積。以進樣濃度（X）為橫坐標，DAS的峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得到線性回歸方程。

以色譜峰面積為縱坐標Y，DAS 濃度為橫坐標，繪制標準曲線。再通過峰面積Y對濃度X進行最小二乘法線性回歸，DAS 的線性回歸方程為Y＝89 944X?4 256.3（r2＝0.999 8），線性范圍為0.5～20 μg·mL－1。結果表明：在線性范圍內DAS 的色譜峰面積與濃度具有良好的線性關系。

2.8 精密度實驗

配制濃度為15 μg·mL－1的DAS 對照品溶液6等份，分別在日內及日間對其重復測定，考察精密度，然后記錄所測得的色譜峰面積，并通過2.4 項下所得的線性方程計算濃度，最后計算出其日內和日間的RSD 值。

精密度試驗結果見表1。其精密度RSD 小于2%，精密度良好，符合《中國藥典》2015 版的規定。

表1 精密度實驗結果（n＝6）

2.9 穩定性試驗

分別取濃度為10 μg·mL－1、15 μg·mL－1、20 μg·mL－1的DAS 對照品溶液，分別在室溫下放置0、1、2、4、8、12 h 后，測定其相應的色譜峰面積，將結果代入線性回歸方程中，計算其RSD值。

通過對不同濃度的DAS 溶液在1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h 不同時間內穩定性的考察，其RSD＜2%，結果表明其穩定性較好，見表2。

表2 穩定性試驗結果（n＝3）

2.10 方法回收率實驗

分別取低、中、高三種不同濃度的DAS 對照品溶液，測定其相應的色譜峰面積，帶入線性回歸方程中，計算DAS 濃度，最后計算回收率及RSD 值。

對1、10.0、20.0 μg·mL－1三個DAS 溶液的濃度進行回收率的測定，測定結果見表3。回收率在99.66%～100.78%之間，RSD 值均小于2%，其回收率符合《中國藥典》的98%～102%之間的規定，符合藥典要求。

表3 方法回收率試驗結果（n＝3）

續表3

2.11 合成產物中DAS?SA 的含量測定

分別取三批合成產物適量，加入少量DMSO溶解后，用甲醇稀釋成適宜濃度的樣品，按照2.2項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，并根據回歸方程計算各樣品中DAS?SA 的相對含量，測定結果見表4。

表4 產率測定結果（n＝3）

由圖6 可知，DAS 的保留時間為9.651，其衍生物的保留時間為13.397，分離度較好。通過面積歸一化法，即〔DAS?SA 的峰面積／除溶劑峰外所有的峰面積之和〕×100%計算，可得出最終產物的純度，再通過產率＝實際產物量×產物純度／理論產物量，可得出該反應產率約為71.16%。

3 討論

本研究利用DAS 上的羥基與SA 開環后的羧基進行酯化反應，通過核磁共振氫譜圖證明了該DAS衍生物被成功合成，然后利用紫外分光光度計對DAS 進行全波長掃描，確定其最大吸收峰位于322 nm。最后建立高效液相色譜法（HPLC）來測定產物中的DAS 衍生物中DAS 的百分含量，并對該反應產率進行計算。結果表明，在該色譜條件下，DAS在0.5～20 μg·mL－1線性范圍內色譜峰面積與濃度具有良好的線性關系（r2＝0.999 8），且精密度、穩定性、方法回收率均符合藥典規定。最終通過色譜峰面積比值得出在本文的反應條件下DAS 衍生物的純度，并通過公式計算得出該反應產率為71.16%，反應產率較高。此外，利用高效液相色譜法對DAS衍生物進行定量分析具有快速高效、重現性好等優點，為DAS 衍生物的含量測定提供方法依據，也為進一步修飾DAS 以改善其理化性質和成藥性奠定基礎。