正交試驗(yàn)法優(yōu)選尿石清合劑的水提醇沉工藝

楊素紅，胡玉良

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院制劑室，中山 528400)

尿石清合劑是本院自制制劑，主治濕熱下注型石淋、熱淋等，用于治療膀胱結(jié)石、腎結(jié)石、輸尿管結(jié)石及泌尿系統(tǒng)感染。其處方主要組成為廣金錢(qián)草、梔子、滑石等[1]。該方系根據(jù)本院治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石的有關(guān)資料，經(jīng)臨床實(shí)踐應(yīng)用幾十年而成。由于原工藝為水提，水提液中含有多種無(wú)效成份和雜質(zhì)，影響了口感和療效。為了減少制劑的體積，提高有效成份的含量，進(jìn)而將此方改為口服液。因此，需要對(duì)工藝進(jìn)行改良，常用的中藥凈化方法為水提醇沉。梔子是方中的君藥，梔子苷是梔子中活性成份，尿石清合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)便以梔子苷為量化指標(biāo)。總固物是常用的水提工藝研究考察指標(biāo)，故選取總固物重量和梔子苷含量為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)水提工藝進(jìn)行優(yōu)選。另外，醇沉是常用的中藥純化工藝，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)選，以篩選最佳制備工藝，為后續(xù)該制劑的進(jìn)一步研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

梔子苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110749-201316，含量以97.5%計(jì))；所用藥材均購(gòu)于廣東致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定[2]；流動(dòng)相采用甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀[安捷倫科技(中國(guó))有限公司]；Inertsil?ODS-3色譜柱(日本島津公司)；BS224S電子天平[賽多利斯(北京)有限公司]。

2 方法與結(jié)果

2.1 總固物重量的測(cè)定

按處方比例稱(chēng)取適量的藥材，加水提取，精密量取提取液25 ml，置于經(jīng)105 ℃干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于105 ℃干燥3 h，取出，移置干燥器中放置30 min，迅速精密稱(chēng)定重量，計(jì)算總固物重量。

2.2 梔子苷含量的測(cè)定[3-5]

2.2.1色譜條件

色譜柱：C18色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水(20∶80)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm。

2.2.2溶液制備

2.2.2.1 供試品溶液

精密量取供試品5 ml于50 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻；再精密量取5 ml于25 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻、過(guò)濾即得。

2.2.2.2 對(duì)照品溶液

精密稱(chēng)取5 mg的梔子苷對(duì)照品于25 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度；再精密量取2 ml于20 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3含量測(cè)定

在上述色譜條件下，精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μl,分別注入液相色譜儀中，測(cè)定梔子苷含量。

2.3 水提工藝研究[2,6-7]

2.3.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水提工藝選取加水量(A)、浸泡時(shí)間(B)、提取時(shí)間(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，按L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，以總固物重量和梔子苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，因素水平選擇見(jiàn)表1。

表1 水提工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

2.3.2試驗(yàn)方法與結(jié)果

稱(chēng)取1/10處方量藥材，共9份，按表1正交試驗(yàn)表試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水提工藝優(yōu)選正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3結(jié)果分析

由表2可知，總固物重量的影響試驗(yàn)因素依次為A>D>B>C，確定梔子的最佳提取條件為A3B1C2D2，即加12倍量水浸泡0.5 h，提取2次，每次1.5 h。梔子苷含量的影響因素依次為B>A>C>D，確定梔子的最佳提取條件為A3B2C3D1，即加12倍量水浸泡1 h，提取1次，提取2 h。綜合考慮，最好的方案為A3B2C3D2，即加12倍量的水，浸泡 1 h，提取2次，每次2 h。

2.3.4驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)所選的最佳提取條件，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。分別按照處方比例，稱(chēng)取藥材，以較優(yōu)的工藝A3B2C3D2提取，分別測(cè)定總固物重量和梔子苷含量，記錄結(jié)果，見(jiàn)表3。

表3 水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

總固物重量和梔子苷含量的RSD分別為0.43%和1.84%，說(shuō)明該工藝科學(xué)合理，質(zhì)量穩(wěn)定。

2.4 醇沉工藝優(yōu)選[8]

2.4.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇藥液相對(duì)密度(A)、含醇量(B)、醇沉?xí)r間(C)為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平；按L9(34)正交試驗(yàn)表,設(shè)9次試驗(yàn)；取適量水提液水浴濃縮至相對(duì)密度分別為1.05、1.10和1.15，取50 ml濃縮液，于60 ℃時(shí)緩緩加入適當(dāng)比例的乙醇，使其含醇量達(dá)到60%、70%和80%，攪拌均勻后分別置室溫放置12、24和48 h，濾過(guò)，濾液置蒸發(fā)皿中，80 ℃水浴濃縮揮發(fā)乙醇至無(wú)醇味，按照“2.2.2.1”制備供試品溶液，測(cè)定梔子苷含量。因素水平見(jiàn)表4。

表4 醇沉工藝優(yōu)選正交試驗(yàn)因素和水平

2.4.2試驗(yàn)方法與結(jié)果

按照優(yōu)選的水提工藝制備藥液，取9份，每份100 ml，按表4正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 醇沉工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4.3結(jié)果分析

由直觀分析可知，影響醇沉效果的因素順序?yàn)锳>C>B，由此得出的最佳工藝組合為A2B1C2，即醇沉濃度60%，藥液初始相對(duì)密度1.10，醇沉?xí)r間24 h。

2.4.4驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)所選的最佳醇沉條件，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，分別測(cè)定梔子苷含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 醇沉工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

梔子苷含量保持在一個(gè)較穩(wěn)定的范圍內(nèi)，RSD為1.16%，說(shuō)明該工藝科學(xué)合理，質(zhì)量穩(wěn)定。

3 討論

尿石清合劑方中含有黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷、有機(jī)酸、皂苷類(lèi)、三萜類(lèi)、甾體類(lèi)、多糖類(lèi)等多種類(lèi)型化學(xué)成份。其中梔子的化學(xué)成份達(dá)100多種，有環(huán)烯醚萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸酯類(lèi)、多糖類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)、長(zhǎng)鏈烷烴類(lèi)等。雖然梔子的化學(xué)成份較為復(fù)雜，但目前對(duì)梔子的利用主要是從梔子中提取梔子黃色素和梔子苷[9]，臨床上用于肝炎、尿路感染等。干浸膏是復(fù)方制劑中發(fā)揮臨床作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，浸膏得率的高低可在很大程度上反映出制劑工藝的優(yōu)劣。因此，最終選擇水提液的總固體物和梔子苷含量作為水提工藝正交試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

水提醇沉是常用的中藥提取工藝[10]，可去除藥液中淀粉、蛋白質(zhì)等大分子，保留生物堿類(lèi)、苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、氨基酸、多糖等有效成份，提高澄明度、降低出膏率、減少患者每日服用量。本研究采用優(yōu)化的水提工藝可獲得干浸膏得率和梔子苷含量均較高的提取物，結(jié)合醇沉工藝除雜質(zhì)，大大提高了制劑質(zhì)量。優(yōu)化的水提醇沉工藝可用于尿石清合劑組方藥材的提取、純化，使制劑具有更高的品質(zhì)，為劑型改良和工業(yè)化大生產(chǎn)提供參考。

由于時(shí)間和條件所限，課題組暫未對(duì)工藝優(yōu)化后的制劑療效進(jìn)行系統(tǒng)研究，日后可繼續(xù)進(jìn)行有關(guān)藥效學(xué)研究和臨床療效觀察，比較醇沉前后提取物的藥效變化，以進(jìn)一步闡明工藝優(yōu)化的價(jià)值。