LncRNA XIST通過海綿吸附miR-133a調控甲狀腺癌細胞的增殖和凋亡*

張娜， 易茂林

(黃岡市中心醫院 乳甲外科, 湖北 黃岡 438000)

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率正逐年攀升[1]。盡管甲狀腺癌患者的治療方法有所發展，但甲狀腺癌容易發生遠處轉移，導致患者預后生存差[2]。甲狀腺癌的發生和發展是一個復雜的過程，深入了解和揭示甲狀腺癌的發病機制，對于有效的診斷和治療是必不可少的。長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA，LncRNA) 是長度大于200 nt的RNA分子，其不編碼蛋白質，但在腫瘤基因表達水平的調控中具有重要的作用，是目前腫瘤學領域研究的熱點[3-4]。多項研究表明LncRNA參與調節腫瘤細胞的增殖、分化、轉移和凋亡等生物學活性[5-7]。X染色體失活基因(X inactivate-specific transcript，XISTX染色體失活基因)是LncRNA成員之一，研究報道XIST在非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和胃癌等惡性腫瘤中表達異常[8-12]，但目前極少報道其在甲狀腺癌中的表達情況和調控機制。microRNAs是一種非編碼RNA，大小約22 nt[13]。據報道，miR-133a在宮頸癌、胃癌、肺癌、結直腸癌等惡性腫瘤中均表達下調[14-17]。近期，一種新的轉錄后調控的觀點被提出，認為lncRNAs與miRNAs相互作用，作為競爭的內源性RNAs(ceRNAs)發揮作用，目前尚無研究報道XIST和miR-133a之間是否存在競爭性結合機制。本研究通過培養甲狀腺癌細胞進行相應處理，探究XIST和miR-133a在甲狀腺癌細胞中的表達情況和對甲狀腺癌增殖、凋亡的影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣本 收集2015年3月—2017年4月行切除術的49例甲狀腺癌患者癌組織和癌旁組織樣本，其中男29例、女20例，41～62歲、平均51.8歲。手術前，所有癌癥患者均未接受化療或放療，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2細胞培養 甲狀腺上皮細胞系Nthy-ori 3-1和甲狀腺癌細胞系TPC-1、FTC-133、SW579、WRO均購自ATCC庫，細胞在含10%胎牛血清(FBS，Gibco，NY，USA)的DMEM培養基中培養。在5% CO2，37 ℃的恒溫加濕培養箱中生長。

1.2 方法

1.2.1細胞分組 將TPC-1和FTC-133細胞分為對照組(Control組)、DMSO處理組(DMSO組)、XIST過表達陰性對照組(oe-NC組)、XIST過表達組(oe-XIST組)、XIST沉默陰性對照組(si-NC組)、si-XIST組(XIST沉默組)、XIST過表達陰性對照與miR-133a過表達陰性對照共轉(oe-NC+NC mimic組)、XIST過表達與miR-133a過表達陰性對照共轉組(oe-XIST+NC mimic組)、XIST過表達陰性對照與miR-133a過表達共轉組(oe-NC+miR-133a mimic組)及XIST過表達與miR-133a過表達共轉組(oe-XIST+miR-133a mimic組)。

1.2.2細胞轉染 對數期TPC-1和FTC-133細胞經胰酶消化后，于轉染前24 h再懸浮制備細胞懸液，然后以1×106細胞/孔的密度接種于6孔板中，孵育18～24 h，使每孔細胞融合率達到80%～90%。轉染前3 h，用不含血清和抗生素的新鮮培養基代替原培養基。采用Lipofectamine 2000(Life Technologies)進行細胞轉染，轉染細胞培養48 h后進行進一步實驗。

1.2.3MTT法檢測細胞增殖 為探究LncRNA XIST對甲狀腺癌細胞增殖的影響，分別培養TPC-1和FTC-133細胞，并對細胞進行XIST過表達和沉默處理，并通過MTT法檢測各組細胞的增殖情況。按照Promega試劑盒的說明操作，用含10%FBS的培養基制備5×104細胞/mL的單細胞懸浮液。將懸浮液加入96孔板(200 μL/孔)中培養3～5 d。轉染后，繼續培養0、24、48和72 h，然后加入20 μL MTT(5 g/L)。MTT孵育4 h后去除上清液，加入200 μL二甲基亞砜溶解，用酶標儀測定490 nm處的OD值，確定細胞增殖情況。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞轉染后48 h，流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。按照PI-Annexin V凋亡檢測試劑盒(BD Bioscience，NJ，USA)的說明測定細胞凋亡。FACS Calibur流式細胞儀(BD Bioscience，NJ，USA)檢測細胞凋亡。采用FACS-Diva軟件BD Bioscience，NJ，USA)對數據進行分析。

1.2.5qRT-PCR檢測LncRNA XIST和miR-133a的表達 培養甲狀腺上皮細胞系Nthy-ori 3-1和甲狀腺癌細胞系TPC-1、FTC-133、SW579、WRO，并通過qRT-PCR檢測各細胞中LncRNA XIST和miR-133a的表達情況。用TRIzol試劑(NE0260，北京雷根生物技術有限公司，北京，中國)提取甲狀腺癌細胞總RNA。利用PrimeScriptⅡ第一鏈cDNA合成試劑盒(TaKaRa，東京，日本)進行RNA逆轉錄后，通過SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)對獲得的cDNA進行qRT-PCR。U6是檢測miR-133a的內參，GAPDH是檢測XIST的內參。用2 ΔCT法計算相對表達。引物由山根生物技術公司(中國上海)合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 LncRNA XIST和miR-133a的表達

LncRNAXIST和miR-133a的表達結果顯示，與癌旁組織比較，甲狀腺癌組織中LncRNAXIST表達降低，miR-133a表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與甲狀腺上皮細胞系Nthy-ori 3-1比較，TPC-1、FTC-133、SW579、WRO細胞中LncRNAXIST表達升高，miR-133a表達降低 ，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與癌旁組織比較，P<0.05；(2)與甲狀腺上皮細胞Nthy-ori 3-1組比較，P<0.05。圖1 甲狀腺癌組織和細胞中LncRNA XIST和miR-133a的表達Fig.1 LncRNA XIST and miR-133a expression in thyroid carcinoma tissues and cells

2.2 XIST對甲狀腺癌細胞增殖的影響

結果顯示，在TPC-1和FTC-133細胞中，0、24、48、72 h 各時點，Control組、DMSO組、oe-NC組和si-NC組細胞增殖能力比較，差異無統計學意義 (P>0.05)。與oe-NC組比較，oe-XIST組TPC-1和FTC-133細胞在48 h和72 h時增殖能力均增強，差異有統計學意義(P<0.05)；與si-NC組比較，si-XIST組TPC-1和FTC-133細胞在48 h和72 h時增殖能力均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為TPC-1細胞0、24、48、72 h時細胞增殖情況統計分析，B為FTC-133細胞0、24、48、72 h時細胞增殖情況統計分析；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。圖2 XIST對甲狀腺癌TPC-1和FTC-133細胞增殖的影響Fig.2 Effects of XIST on the proliferation of thyroid carcinoma TPC-1 and FTC-133 cells

2.3 XIST對甲狀腺癌細胞凋亡的影響

在甲狀腺癌TPC-1和FTC-133細胞中，Control組、DMSO組、oe-NC組和si-NC組細胞凋亡比例比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與oe-NC組比較，oe-XIST組TPC-1和FTC-133細胞凋亡比例降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與si-NC組比較，si-XIST組TPC-1和FTC-133細胞凋亡比例升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：A為TPC-1細胞經處理后的細胞凋亡率，B為FTC-133細胞經處理后的細胞凋亡率；(1)與oe-NC組比較，P<0.05；(2)與si-NC組比較，P<0.05。圖3 XIST對甲狀腺細胞凋亡的影響Fig.3 Flow cytometry detection on apoptosis of each group

2.4 miR-133a對LncRNA XIST的影響

在甲狀腺癌TPC-1和FTC-133細胞中，與oe-NC+NC mimic比較，oe-XIST+NC mimic組細胞中XIST表達升高，oe-NC+miR-133a mimic組細胞中miR-133a表達升高，oe-XIST+miR-133a mimic組細胞中XIST和miR-133a表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與oe-XIST+NC mimic比較，oe-XIST+miR-133a mimic組細胞miR-133a表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為TPC-1細胞中LncRNA XIST和miR-133a的基因表達，B為FTC-133細胞中LncRNA XIST和miR-133a的基因表達；(1)與oe-NC+NC mimic組比較，P<0.05；(2)與oe-XIST+NC mimic組比較，P<0.05。圖4 miR-133a對LncRNA XIST的影響Fig.4 Effect of miR-133a on LncRNA XIST

2.5 XIST通過吸附miR-133a，影響甲狀腺癌細胞增殖

與oe-NC+NC mimic比較，oe-XIST+NC mimic組TPC-1和FTC-133細胞48 h和72 h時增殖能力增強， oe-NC+miR-133a mimic組TPC-1和FTC-133細胞48 h和72 h時增殖能力降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與oe-XIST+NC mimic比較，oe-XIST+miR-133a mimic組TPC-1和FTC-133細胞增殖48 h和72 h時能力降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

注：(1)與oe-NC+NC mimic組比較，P<0.05；(2)與oe-XIST+NC mimic組比較，P<0.05。圖5 XIST對甲狀腺癌TPC-1和FTC-133細胞在48、72 h時點細胞增殖的影響Fig.5 Effect of XIST on carcinoma cell proliferation

2.6 XIST通過吸附miR-133a對甲狀腺癌細胞凋亡的影響

與oe-NC+NC mimic比較，oe-XIST+NC mimic組TPC-1和FTC-133細胞凋亡比例降低，oe-NC+miR-133a mimic組細胞凋亡比例升高(P<0.05)；與oe-XIST+NC mimic比較，oe-XIST+miR-133a mimic組TPC-1和FTC-133細胞凋亡比例升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

注：A為TPC-1細胞，B為FTC-133細胞；(1)與oe-NC+NC mimic組比較，P<0.05；(2)與oe-XIST+NC mimic組比較，P<0.05。圖6 XIST通過吸附miR-133a后甲狀腺癌各組細胞凋亡情況Fig.6 Apoptosis of each group after XIST absorption of miR-133a

3 討論

甲狀腺癌的臨床治療策略，包括放射性碘治療、甲狀腺切除術和促甲狀腺激素抑制治療，但其療效并不理想，患者5年生存率并不令人滿意[18]。深入研究甲狀腺癌的發病機制具有重要意義，可為甲狀腺癌的診斷和治療提供更有效的策略。LncRNA不編碼蛋白質，但在染色質重塑、結構支架和轉錄基因調控等過程中具有非常重要的作用[19-21]。LncRNA XIST是研究較多的LncRNAs成員之一，XIST在多種惡性腫瘤中異常表達，并被視作腫瘤的預后標志物之一[22-24]。本研究通過培養甲狀腺上皮細胞系和甲狀腺癌細胞系，并檢測各細胞系中XIST的表達情況，結果顯示，XIST在甲狀腺癌細胞系的表達均異常上調；且過表達XIST會導致甲狀腺癌細胞增殖能力增強，凋亡比例顯著降低；而下調XIST的表達，可顯著抑制甲狀腺癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，此結果與Liu等[25]研究結果一致，此結果提示XIST的表達變化可調控甲狀腺癌細胞增殖和凋亡。

近年來，多項研究發現XIST可能通過吸附microRNA，進而發揮基因表達調控作用[26]。Zhu等[27]研究報道XIST可通過競爭性結合miR-200a，加速宮頸癌的發展。Zong等[28]研究報道XIST可通過吸附miR-125b-5p，促進乳腺癌的進展。Zhang等[29]研究報道XIST通過吸附miR-200c-3p，促進乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥。本研究通過檢測發現XIST可吸附miR-133a，這與Wei等報道一致[30]。進一步對細胞進行XIST和miR-133a共轉染處理，并檢測細胞的增殖和凋亡變化情況。結果顯示，過表達miR-133a抑制甲狀腺癌細胞增殖，并促進細胞凋亡；且過表達miR-133a可改善XIST對甲狀腺癌細胞增殖能力的促進作用和細胞凋亡的抑制作用，此結果提示XIST通過吸附miR-133a，進而促進甲狀腺癌細胞增殖，抑制甲狀腺癌細胞凋亡。

綜上所述， XIST過表達促進甲狀腺癌細胞增殖，抑制甲狀腺癌細胞凋亡。XIST對甲狀腺癌細胞增殖和凋亡情況的調控可通過吸附miR-133a實現。本研究通過細胞實驗，檢測到XIST在甲狀腺癌中的表達情況，并進一步完善XIST對甲狀腺癌細胞增殖和凋亡影響的機制，為甲狀腺癌的發展提供了新的思路，并為臨床上治療甲狀腺提供新的理論依據。但目前本研究尚未進行更深入的機制探究，進一步探究miR-133a可能的下游靶標，且研究范疇仍局限于體外細胞實驗，下一步本研究將進一步通過體內實驗，驗證XIST/miR-133a在甲狀腺癌中的調控機制。