miR-130a通過調控PTEN對缺血性腦卒中神經功能的影響*

姚麗娜， 張鵬舉

(保定市第二中心醫院， 河北 保定 071000)

缺血性腦卒中的主要病因是頸動脈和(或)椎動脈提供血液的動脈狹窄或閉塞，大腦供血不足所致的腦缺血性損傷[1]。腦缺血性損傷是一個復雜的病理生理過程，涉及能量衰竭、酸中毒、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、線粒體損傷、氧化應激及炎癥反應等 ，最終導致細胞壞死或凋亡[2-4]。對急性腦缺血最有效的治療方法是在適當的時間窗口內進行溶栓再灌注[5-7]。miRNA參與調節各種病理生理過程，這些過程與細胞凋亡、增殖和個體發育密切相關[8]，miR-130a的表達在缺血再灌注后增加，并且與患者的治療效果和預后密切相關[9]。磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)作為具有磷酸酶活性的癌癥抑制基因，在腦損傷中的作用逐漸受到關注[10]。PTEN可負性調控Akt/PKB信號通道，參與由腦缺血再灌注誘導的應激反應[11]。目前關于miR-130a對腦缺血和PTEN/PI3K/Akt信號通路影響的研究較少，本研究旨在探究miR-130a通過PTEN/PI3K/Akt信號通路對神經元功能是否有保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只、體質量250～280 g，在溫度(23±2)℃、濕度(45±5)%、無特定病原體的環境中，規律晝夜節律適應性喂養1周。

1.1.2藥物與試劑 10%水合氯醛(上海碧云天公司)，miR-130a模擬物(Genechem公司，上海)，陰性對照載體(Genechem公司，上海)，Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司，美國)，TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)，RNA提取試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，pGL3報道載體(Promega公司，美國)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白介素-6(interleukin-6，IL-6)和白介素-10(interleukin-10，IL-10)ELISA試劑盒(上海碧云天公司)，TUNEL試劑盒(上海碧云天公司)，放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解緩沖液(北京TDY Biotech公司)，小鼠抗大鼠p-Akt單克隆抗體(Invitrogen公司，美國)，小鼠抗大鼠p-GSK3β單克隆抗體(Invitrogen公司，美國)，小鼠抗大鼠p-c-Raf單克隆抗體(Invitrogen公司，美國)，小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體(Invitrogen公司，美國)，山羊抗兔二抗(上海碧云天公司)。

1.1.3主要儀器 雙重熒光素酶報告系統(Promega公司，美國)，Gen5酶標儀(BioTek，美國)。

1.2 方法及觀察指標

1.2.1動物分組 60只大鼠隨機分為對照組(正常飼養，假手術處理，n=20)、模型組(缺血性腦卒中模型，n=20)和模擬轉轉染組(將miR-130a模擬轉染注射到大鼠的側腦室，n=20)，實驗獲河北省動物倫理學委員會的批準(審批號2019322)。

1.2.2模型制備 對照組僅切開皮膚不做進一步處理即縫合皮膚。模型組和模擬轉染組大鼠，10%水合氯醛以300～350 mg/kg腹腔注射麻醉，頸正中縱向切口、分離皮下組織，用動脈夾鉗夾頸總動脈、在頸外動脈上做一個小切口、插入縫合線至頸內動脈以阻斷大腦中動脈的血液供應。放開頸總動脈夾后，將大鼠飼養在單獨的籠子中直至復蘇，并觀察飲水狀態和傷口。對照組未插入縫合線，其余操作與模型組同。在放開勁總動脈夾之前，保留縫合線的情況下對頸外動脈的切口進行縫合，并予以青霉素抗感染治療。

1.2.3神經學受損功能評分 于手術后第1、10和15天時，采用改良的神經損傷嚴重程度評分量表(mNSS)評估各組大鼠的神經缺陷程度。mNSS標準分數從0分(正常)～21分(最大缺陷分數)，得分越高提示神經功能受損程度越高。

1.2.4細胞轉染方法 mNSS測試后處死大鼠，采用PCR檢測miR-130a和PTEN mRNA轉錄水平，分離手術側腦組織，加入質量/體積比為100 g/L的TRIzol試劑(Invitrogen公司，美國)。應用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測miR-130a和PTEN基因的表達情況，miR-130a上游引物miR-130a-F為5′-ACACTCCAGCTGGGGCTCTTTTCACATTGT-3′,下游引物miR-130a-R為5′- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT CAGTTGAGAGTAGCAC-3′。PTEN上游引物PTEN-F為5′-GTGCAGATAATGACAAG-3′，下游引物PTEN-R為5′-GATTTGACGGCTCCTCT-3′。PCR擴增時64 ℃退火，延伸40 s，循環30次；并以GAPDH作為內參照，上游引物GAPDH-F為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物GAPDH-R為5′-GTGCAGATAATGACAAG-3′;PCR擴增時62 ℃退火，延伸10 s，循環30次。結束后取反應液5 μL進行濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統檢測PCR產物。模型組和模擬轉染組大鼠的腦皮質細胞實施質粒轉染。具有miR-130a模擬物，陰性對照載體獲自Genechem公司(上海)，以適當的密度接種后，使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司，美國)轉染細胞。細胞培養至密度為70%左右，采用0.25%胰酶消化細胞，完全培養基1 mL重懸細胞并計數。將細胞分為對照組、miR-130a抑制物陰性對照組和miR-130a抑制物組，分別接種于6孔板，每組3個復孔，置于5% CO2、37 ℃培養箱內培養24 h。miR-130a抑制物陰性對照組和miR-130a抑制物組采用脂質體2 000以100 pmol/LmiR-130a抑制物陰性對照或miR-130a抑制物轉染細胞，于5% CO2、37 ℃培養箱內培養6 h后，更換完全培養基繼續培養48 h，實時熒光定量PCR技術驗證轉染效率(計算方法：轉染時質粒攜帶熒光標記，計算流式細胞儀檢測后的熒光細胞比例)，進行后續實驗。

1.2.5螢光素酶法測定野生型-PTEN和突變型-PTEN表達的熒光素酶活性 將野生和突變的PTEN的3′UTR(PTEN3′UTR-WT或3′UTR-MUT)分別插入pGL3報道載體(Promega公司，美國)的下游，將帶有miR-130a模擬物/抑制劑和PTEN-pGL3報告基因的載體共轉染到腦組織中。轉染后2 d，使用雙重熒光素酶報告系統(Promega公司，美國)在Gen5酶標儀(BioTek，美國)上評估野生型-PTEN和突變型-PTEN表達的熒光素酶活性。

1.2.6TNF-α、IL-6和IL-10表達的測定 分離手術側腦組織，使用ELISA試劑盒測量腦組織中TNF-α、IL-6和IL-10表達。

1.2.7TUNEL染色確定細胞凋亡水平 分離手術側腦組織，制成石蠟切片。通過TUNEL染色檢測腦組織的神經元凋亡水平：去石蠟，切片用3%過氧化氫處理10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，滴加蛋白酶K溶液，37 ℃孵育10 min；PBS沖洗3次，滴加TdT和DIG-d-UTP溶液，4 ℃孵育2 h；將切片用PBS沖洗3次后，在室溫下用40 μL封閉緩沖液密封30 min，滴加抗體(1 ∶100)，37 ℃的濕箱中孵育30 min；將切片用PBS沖洗3次后，滴加SABC-FITC二抗(1 ∶100)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次；共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照，記錄缺血半球中TUNEL陽性細胞數。

1.2.8蛋白質印跡法(Western blot)檢測p-AKT、p-GSK3β和p-c-Raf蛋白的表達 分離手術側腦組織，稱重后加入放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解緩沖液(北京TDY Biotech公司)，質量/體積比為100 g/L以及1%的磷酸酶抑制劑和1%的蛋白酶抑制劑，勻漿、10 000 g和4 ℃下離心10 min，對總蛋白進行定量。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，在80 V下添加等體積的蛋白質樣品進行電泳，濕法轉膜；用新鮮制備的5%脫脂奶粉將蛋白條帶密封1 h，與p-Akt(1 ∶1 000)、p-GSK3β(1 ∶1 000)、p-c-Raf(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)在4 ℃過夜；用含Tween-20(TBST)的Tris緩沖鹽水洗滌3次(5 min/次)，與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1 ∶5 000，上海碧云天公司)、室溫下放置1 h，TBST洗滌3次(5 min/次)，TBST洗膜5 min×3次，加人顯影液,顯影并拍照掃描后用Image J軟件計算各條帶的灰度值，并以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 mNSS評分

與對照組比較，模型組在第1、10、25時的mNSS評分均升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，模擬轉染組大鼠在手術后第10、25天時mNSS評分均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與術后第1天比較，模擬轉染組大鼠在手術后第10、25天時mNSS評分均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。提示隨著手術時間的推延，miR-130a模擬物可降低模型組大鼠mNSS評分，miR-130a的表達可降低大鼠神經細胞的功能損傷程度。見表1。

表1 各組大鼠mNSS評分Tab.1 mNSS scores of rats in each group

2.2 miR-130a和PTEN mRNA表達

與對照組比較，模型組大鼠手術側腦組織的miR-130amRNA表達降低，PTENmRNA表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，模擬轉染組大鼠手術側腦組織miR-130amRNA表達升高，PTENmRNA表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 手術側腦組織miR-130a和PTEN mRNA表達Tab.2 Expression of miR-130a and PTEN mRNA in cerebral tissue of surgery side

2.3 野生型-PTEN和突變型-PTEN表達的熒光素酶活性

與對照組比較，模擬轉染組腦組織的野生型-PTEN表達降低，突變型-PTEN表達也降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組大鼠野生型-PTEN和突變型-PTEN表達的熒光素酶活性Tab.3 Luciferase activity of wild-type-PTEN and mutant -PTEN

2.4 TNF-α、IL-6和IL-10表達

與對照組比較，模型組大鼠手術側半球腦組織IL-10含量降低，IL-6和TNF-α含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，模擬轉染組IIL-10含量升高，IIL-6和TNF-α含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠手術側腦組織TNF-α、IL-6和IL-10表達Tab.4 Expression of TNF-α, IL-6, and IL-10 in brain tissue of rats in each group

2.5 腦細胞的凋亡

與對照組比較，模型組大鼠手術側腦組織切片 TUNEL陽性細胞數量升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，模擬轉染組TUNEL陽性細胞數量減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表5。

對照組 模型組 模擬轉染組圖1 各組大鼠手術側腦組織細胞凋亡水平(TUNEL染色)Fig.1 Apoptosis level of each group (TUNEL staining)

表5 TUNEL陽性細胞數Tab.5 Number of TUNEL positive cells

2.6 p-AKT、p-GSK3β和p-c-Raf蛋白表達

與對照組比較，模型組大鼠手術側腦組織勻漿中 p-AKT(Ser473)、p-GSK3β(S9)、p-c-Raf(Ser338)蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，模擬轉染組p-AKT、p-GSK3β、p-c-Raf蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)，提示miR-130a促進了PI3K/AKT途徑的發生。見表6、圖2。

表6 各組大鼠手術側腦組織p-AKT、p-GSK3β和p-c-Raf蛋白表達Tab.6 Expression of p-AKT, p-GSK3β ,and p-c-Raf proteins in brain tissues of rats in each group

圖2 各組大鼠手術側腦組織p-AKT、p-GSK3β和p-c-Raf蛋白的表達Fig.2 Expression of p-AKT, P-GSK3β, and p-c-Raf

3 討論

缺血性腦卒中是導致死亡的嚴重疾病，缺血性腦卒中血腫的數量和患者的并發癥是影響預后的重要因素，可用于評估患者的預后[12-14]。根據世界衛生組織的流行病學調查，中風導致的死亡人數在所有主要疾病中排名第二，中風的特征是急性發作，高死亡率和許多并發癥[15]。中國已逐漸步入人口老齡化階段，中風已成為第一大死亡原因。中風具有較高的死亡率和致殘率，腦梗死后隨著空間的占用而迅速發生水腫，導致顱內高壓和腦疝，并導致死亡[16]。miRNA是一組在體內起調節作用的非編碼RNA，其廣泛存在于許多真核生物中，與個體發育，能量代謝，細胞增殖和凋亡密切相關。miR-21和miR-181b等miRNA參與腦水腫的形成，其是影響中風患者預后的重要因素[17]。miR-130a是一種抗血管生成的轉錄因子。miR-130a在具有短暫缺血性腦卒中的糖尿病大鼠中也起著重要的調節作用[18]。本研究發現，模型組缺血性腦卒中組織中miR-130a的表達降低，行為實驗結果表明模型組存在嚴重的神經損傷。干預腦組織中miR-130a的表達后，神經功能得以有效恢復，這說明miR-130a的高表達可能與缺血性腦卒中大鼠腦損傷密切相關。PTEN是具有磷酸酶活性的癌癥抑制基因，與細胞侵襲，遷移和凋亡有關[19]。PI3K是PTEN的最重要底物，是細胞增殖的重要信使，PTEN可特異性作用于PI3K來調節Akt的磷酸化。p-Akt可直接或間接調節凋亡蛋白的活性，從而干擾細胞增殖并阻止細胞周期，并最終導致凋亡[20]。PTEN磷酸化后，將導致結構不穩定，磷酸酶活性將喪失。本研究發現，腦卒中會升高腦組織中PTEN的磷酸化水平，從而抑制PI3K/Akt并導致大鼠神經元損傷。本研究中模型組腦組織神經元凋亡水平升高，促炎因子IL-6和TNF-α水平升高，而抗炎因子IL-10水平降低。

本研究發現，在模型miR-130a均下調，且miR-130a通過PTEN/PI3K/AKT信號通路保護了腦I/R損傷，為急性腦I/R損傷的診斷和治療提供了新思路。miR-130a與多種疾病有關，包括腫瘤和腦缺血性損傷。miR-130a在食管鱗狀細胞癌的腫瘤生物學中起著至關重要的作用。miR-130a在胃癌中被上調并促進血管生成和細胞生長。缺血性卒中患者血漿中miR-130a水平的降低與疾病風險呈負相關。miR-130a在腦缺血損傷中的表達降低。據報道，抑制PTEN增加了PI3K/AKT軸的激活。PTEN可作為miR-21的靶標，可參與針對心肌損傷的保護作用。PTEN作為miR-130a的靶標，并推翻了miR-130a在腦I/R損傷中的神經保護作用。除此之外，miR-130a過表達通過抑制PTEN增強了PI3K/AKT軸的激活。

綜上所述，miR-130a還可通過激活PI3K/AKT軸和抑制PTEN來防止缺血性卒中引起的神經功能缺損。