沉默Ndfip2對肝癌細胞遷移和侵襲的影響*

張強， 羅彩云， 孫達權， 曾志銳， 鄭志菊， 徐國強,3**

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴陽市第二人民醫院 手術室， 貴州 貴陽 550023； 3.貴州醫科大學第三附屬醫院 醫學研究中心， 貴州 都勻 558000)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的人類惡性腫瘤之一，每年約有80萬人因HCC而死亡，是死亡率較高的腫瘤[1]。近幾年來肝癌患者通過手術切除、器官移植和化學治療等方法有效地延長生命，然而即使經過有效的治療，患者的總體生存率依舊較差，其1年和3年生存率分別為20%和5%，其中腫瘤的高復發率和轉移率仍是導致HCC死亡的主要原因[2]。因此對HCC復發與轉移發病的機制研究、尋求最佳分子療法的靶標，可望成為有效治療肝癌新的希望。Nedd4家族交互作用蛋白2(Nedd4 family interacting protein 2，Ndfip2)是Nedd4家族交互作用蛋白中的一員，可與Nedd4家族成員結合，能夠激活E3泛素連接酶，影響泛素化進行。研究發現Nedd4在腫瘤細胞上皮-間充質轉化(EMT)過程中起著至關重要的作用，Nedd4的下調導致EMT表型部分回復到間充質-上皮轉化(MET)表型特性，在腫瘤細胞的轉移過程中起關鍵作用[3]。為了進一步探究Ndfip2對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本實驗采用免疫組化En Vision染色法和蛋白印跡法檢測Ndfip2在肝癌組織和和肝癌細胞SMMC-7721、HepG2中的表達，通過Ndfip2 小干擾RNA(small interfering RNA，si-Ndfip2)靶向沉默肝癌細胞中Ndfip2的表達，探究Ndfip2對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響及作用機制，為肝癌的治療提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

1.1.1細胞株 人正常肝細胞株LO2、人肝癌細胞株SMMC-7721和HepG2均購自中國科學院昆明細胞庫。

1.1.2肝癌及其癌旁組織標本 病理科生物樣本庫中16例肝癌手術患者(未經化療)的肝癌及其癌旁組織(距離肝癌組織邊緣2 cm處)標本，收集樣本進行研究之前，獲得患者簽署知情同意，本研究得到醫院倫理委員會批準。

1.1.3試劑 RPMI-1640培養基(批號8121283)和青-鏈霉素購自美國HyClone公司，新生牛血清(FBS) 購自四季青公司(批號20010503)，二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司，PVDF膜購自Millipore公司(批號R0BB23468)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶生物公司，BCA蛋白濃度定量試劑盒購自上海碧云天生物技術公司(批號20200519)，RIPA裂解液和PMSF酶抑制劑購自武漢博士德生物公司(批號20200804)，高敏ECL曝光液購自上海碧云天生物技術公司(批號P0018AS-2)，兔抗人Nedd4家族交互作用蛋白2(Nedd4 family interacting protein 2，Ndfip2)多克隆抗體購自美國Affinity公司(批號DF2596)，兔抗人E-鈣黏蛋白(E-cadherin,批號AF0131)、兔抗人N-鈣黏蛋白(N-cadherin,批號BS2224)、兔抗人波形蛋白(Vimentin)多克隆抗體購自武漢三鷹公司(批號10366-1-AP)，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH)多克隆抗體購自巴傲得生物科技有限公司(批號YM32215)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(二抗)購自武漢三鷹公司(批號AA122028)，si-RNA Ndfip2序列由上海吉瑪基因公司合成，LipofectamineTM 2000購自美國Invitrogen公司(批號2150081)。

1.2 方法

1.2.1Ndfip2表達 肝癌組織和癌旁組織標本采用EnVision染色法，染色嚴格按照試劑盒說明書進行。每張切片由兩位病理醫師在高倍鏡(×400)隨機選取5個視野進行單獨評分：染色強度分為0分(陰性)、1分(弱陽性)、2分(陽性)、3分(強陽性)，特異性陽性染色分為0分(<5%)、1分(6%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)和4分(>75%)；最終分數為染色強度得分和特異性陽性染色得分乘積表示， 0～4分為基因低表達組、 4分以上為高表達組。

1.2.2細胞培養 人正常肝細胞株LO2、人肝癌細胞株SMMC-7721和HepG2用RPMI-1640培養基(10%FBS、1%青-鏈霉素)、37 ℃、5% CO2培養箱內進行常規培養，當細胞融合率為70%～80%時，用0.25%胰酶消化并傳代、進行后續的實驗，此4種細胞均為貼壁生長。

1.2.3Ndfip2 si-RNA轉染肝癌細胞 將細胞按1×106個/孔，鋪于12孔板待長到50%～70%時對細胞進行瞬時轉染，轉染前2 h將12孔換成新鮮無血清RPMI-1640培養基，取siRNA(1 D)，瞬時離心后加入DEPC125 μL處理水配成工作溶液。取兩個1.5 mL離心管，一管加入4 μL Lipo2000與無血清RPMI-1640培養基200 μL后混勻、另一管加入4 μL siRNA與200 μL無血清RPMI-1640培養基后混勻，室溫靜置5 min，混勻上述兩個離心管中的液體，室溫靜置20 min，實驗組中每孔各加入204 μL混合液，然后每孔補充796 μL無血清RPMI-1640培養基；繼續培養6 h后換成含20 % FBS的新鮮RPMI-1640培養基。Ndfip2特異性si-RNA的正義鏈序列為5′-GGAAGAGUGUCCACCAACATT-3，反義鏈序列為5′-UCUUGGUGGACACUCUUCCTT-3′；陰性對照的正義鏈序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反義鏈序列為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。

1.2.4實驗分組 SMMC-7721細胞的 Ndfip2-siRNA沉默對照組(NC)和Ndfip2沉默組(si-Ndfip2)，HepG2細胞的Ndfip2-siRNA沉默對照組(NC)和Ndfip2沉默組(si-Ndfip2)。

1.2.5劃痕實驗檢測肝癌細胞的遷移 將轉染完成的各組細胞按每孔1×106個細胞鋪于12孔板中，待細胞生長至100 %密度時在孔中央使用10 μL的無菌槍頭做“十字”劃痕，PBS清洗3次以去掉懸浮的細胞，加入不含血清的RPMI-1640培養液1 mL繼續培養，分別在0即刻、24 h于顯微鏡下觀察細胞的狀態并拍照。采用Image J軟件測量遷移面積，并進行統計學分析。計算細胞遷移率，細胞遷移率(%)=(總面積-空白面積)/總面積×100%。

1.2.6Transwell實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲 遷移實驗：收集轉染完成的各組細胞，按每室1×105個細胞制成無血清RPMI-1640懸液200 μL，鋪于8 μm孔徑Transwell小室，后將小室移至含10% 血清培養液600 μL的下室中，繼續培養細胞；48 h時取出，用4 %的多聚甲醛溶液固定細胞10 min，0.1%結晶紫染色20 min、雙蒸水沖洗浸泡數次，輕柔去除上層的細胞。經烘箱干燥后，置于光學顯微鏡40倍鏡下隨機采集5個視野細胞計數，以此表示細胞遷移能力。侵襲實驗：預先以4 ℃預冷的無血清RPMI-1640培養基和Matrigel按11 ∶1的體積比例稀釋后，每孔100 μL，均勻鋪在上室，放入培養箱中靜置2 h使其干成膠狀；取出小室，棄上清液后加PBS于上室和下室平衡15 min，然后除去PBS，剩余步驟同Transwell遷移實驗。

1.2.7Western blot檢測Ndfip2、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表達 收集各組細胞，經RIPA裂解液裂解，使用BCA定量法進行定量，配制10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，每孔蛋白上樣量為10 μL；將蛋白轉至PVDF膜，37 ℃、5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(兔抗人Ndfip2、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin)4 ℃孵育過夜、洗膜(1×TBST，3次，5 min/次)，二抗[辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔(所有二抗體積稀釋度均為1 ∶2 000)]室溫孵育2 h、洗膜，在膜上均勻鋪上曝光液ECL，在凝膠成像系統內測定結果，用Quantity One系統分析目的條帶并獲取目的條帶的灰度值進行分析。本實驗使用GAPDH作為蛋白質標準化的內參，用目的蛋白的灰度值與內參蛋白的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Ndfip2表達

免疫組化結果顯示，與癌旁組織比較，肝癌組織中Ndfip2表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1A～B。蛋白印跡法結果顯示，與正常肝細胞LO2比較，Ndfip2在肝癌細胞SMMC-7721、HepG2表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1C～D。

注：A、B為Ndfip2在肝癌組織和癌旁組織的表達(1HC，×400)，(1)與癌旁組織比較，P<0.05；C、D為Ndfip2在正常肝細胞和肝癌細胞中的表達(Western blot)，(1)與LO2細胞比較，P<0.05。圖1 Ndfip2在肝癌組織和細胞株中的表達Fig.1 The expression of Ndfip2 in HCC tissues and cell strains

2.2 Ndfip2低表達細胞株

Western blot法結果顯示，si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細胞中的Ndfip2的表達水平較NC組細胞顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2A～C。提示Ndfip2低表達肝癌細胞株構建成功。

注：A、B為Western blot條帶灰度結果，C為相對定量結果； (1)與NC組比較，P<0.05。圖2 SMMC-7721和HepG2細胞的Ndfip2低表達細胞株(Western blot)Fig.2 SMMC-7721 and HepG2 cells with low expression of Ndfip2 (Western blot)

2.3 Ndfip2對肝癌細胞遷移及侵襲能力的影響

劃痕實驗結果顯示，與NC組比較，si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細胞的遷移面積均減小, 差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3A～B。Transwell實驗結果顯示，與NC組比較，si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細胞的遷移細胞數及侵襲細胞數均減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3C～F。

注：A 、B為劃痕實驗結果(×40)，C、D為Transwell遷移實驗結果(×40)，E、F為Transwell侵襲實驗結果(×40)；(1)與NC組比較，P<0.05。圖3 Ndfip2對肝癌細胞遷移及侵襲能力的影響Fig.3 The effect of Ndfip2 on the migration and invasion of HCC cells

2.4 沉默Ndfip2對肝癌細胞E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白的影響

倒置顯微鏡下觀察NC組、si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細胞的形態學變化，結果發現與NC組比較，si-Ndfip2組部分SMMC-7721和HepG2細胞形態發生改變，由長梭形或紡錘形轉變為規則的鋪路石樣，形態往上皮樣轉化。見圖4A。蛋白印跡法結果顯示，與NC組比較，si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細胞的E-cadherin蛋白表達顯著上調；而N-cadherin和vimentin蛋白表達則顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4B～E。

注：A為倒置顯微鏡觀察肝癌細胞形態變化(×400)，B～E為SMMC-7721Western blot結果圖；(1)與NC組比較，P<0.05。圖4 Ndfip2低表達后EMT標記蛋白表達情況Fig.4 The expression levels of EMT marker protein after Ndfip2 low expression

3 討論

肝癌是全球最為普遍的惡性腫瘤和主要致死原因之一。盡管在肝癌的治療方法方面取得了一些進展，但切除肝癌后的轉移和復發率依然很高，這是導致臨床治療失敗和患者死亡的主要原因之一[4-5]，因此探尋并闡明肝癌發展和轉移的機制對于肝癌的臨床治療和防治極其重要，這也是人們一直潛心研究的重要課題和努力方向。泛素化是一種翻譯后修飾，影響多種細胞過程，對于細胞體內穩態的維持至關重要。在三酶級聯反應中，E3泛素連接酶通過募集底物并促進或直接催化泛素轉移至靶標，因而在很大程度上決定了泛素化反應的特異性[6]。研究發現E3泛素連接酶的遺傳改變，異常表達或功能障礙是人類癌癥發生和發展的原因[7]。例如E3泛素連接酶NEDD4家族，研究發現，NEDD4在非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系中的過表達促進了NSCLC細胞生長，而NEDD4的沉默則顯著抑制了NSCLC細胞在體內和體外的增殖[8]。Ndfip2，全稱Nedd4家族交互作用蛋白2，可與Nedd4家族成員蛋白的 WW 結構域結合并其家族成員，是E3泛素連接酶Nedd4家族的激活因子，影響蛋白質泛素化的進程[9]。最新研究發現其同源蛋白質Ndfip1可以通過AKT/mTOR介導的Warburg效應促進人肝癌細胞SMMC-7721的轉移[10]，然而Ndfip2對肝癌的作用卻鮮有報道，因此本課題組通過免疫組化和蛋白印跡法檢測了肝癌組織和肝癌細胞SMMC-7721和HepG2中Ndfip2 的表達，實驗結果表明與癌旁組織和正常肝細胞LO2相比，肝癌組織和肝癌細胞SMMC-7721和HepG2中Ndfip2表達顯著升高。為了進一步研究Ndfip2對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響，本實驗通過Ndfip2 si-RNA轉染SMMC-7721和HepG2靶向沉默肝癌細胞中Ndfip2表達，通過劃痕實驗和transwell實驗評價Ndfip2對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響，結果顯示相對于NC組，si- Ndfip2組遷移面積和遷移侵襲細胞數均顯著減少，提示沉默Ndfip2顯著抑制肝癌細胞SMMC-7721和HepG2的遷移和侵襲能力。

EMT是上皮細胞向間質細胞表型的轉變過程，也是上皮細胞失去極性并獲得遷移和侵襲能力的過程。大量實驗表明，EMT的生物學過程被認為是致癌作用的關鍵標志，靶向EMT途徑是一種有潛力的癌癥治療策略[11]。EMT的標志是上皮標志物表達的喪失，通常由E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的存在來表明，而間充質標志物表達(如N-cadherin和Vimentin)的增加伴隨著侵襲性表型的改變[12]。本實驗在倒置顯微鏡下觀察NC組和si-Ndfip2組SMMC-7721和HepG2細胞的形態學變化，發現SMMC-7721和HepG2細胞沉默Ndfip2后，部分肝癌細胞形態及體積縮小，呈現上皮樣改變。采用蛋白印跡法檢測結果顯示當SMMC-7721和HepG2細胞中Ndfip2低表達后，E-cadherin的蛋白表達顯著上調,而N-cadherin和vimentin的蛋白表達則顯著下調，提示沉默Ndfip2可能抑制EMT的發生。