乳腺癌中關(guān)鍵基因及靶向治療化合物的篩選*

劉敏， 黃健,， 晏嬌艷， 楊燁， 袁艷， 何蕓， 宋孝晗， 莫非,， 羅昭遜， 張姝,**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)與血液學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)中心， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

乳腺癌(breast cancer, BC)是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤[1]，由于其發(fā)病早期缺乏典型性和特異性臨床癥狀及體征，多數(shù)患者臨床確診時(shí)已發(fā)展至中晚期，成為導(dǎo)致女性BC死亡的最大原因[2]。目前臨床診斷BC常用的病理學(xué)、影像學(xué)及血清腫瘤標(biāo)志物等方法存在的某些不足，限制了它們?cè)贐C診斷中的應(yīng)用。隨著基因組技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)譜分析，可以有效地識(shí)別差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)及其作用的相關(guān)通路，也發(fā)現(xiàn)某些疾病特異性的生物標(biāo)志物[3-4]。因此，本研究利用生物信息學(xué)相關(guān)工具從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO)中檢索并整合分析與BC相關(guān)的數(shù)據(jù)集獲得DEGs，預(yù)測(cè)其功能及在BC中的作用；選取乳腺外科30對(duì)BC組織及癌旁組織，從mRNA水平和蛋白質(zhì)層面驗(yàn)證其表達(dá)，同時(shí)采用Cmap (connectivity map, Cmap)數(shù)據(jù)庫(kù)分析和挖掘與DEGs具有相互作用的候選化合物，以期為研發(fā)治療BC的潛在化合物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1數(shù)據(jù)集 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載3個(gè)獨(dú)立的BC微陣列數(shù)據(jù)集GSE109169、GSE42568和GSE15852。GSE109169數(shù)據(jù)集基于GPL5175(HuEx-1_0-st) Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array[transcript (gene) version] 平臺(tái)，包括25例BC組織樣本和25例正常乳腺組織；GSE42568中有104例BC組織樣本和17例正常乳腺組織，是基于GPL570(HG-U133_Plus_2) Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺(tái)檢測(cè)的；GSE15852數(shù)據(jù)集基于GPL96(HG-U133A) Affymetrix Human Genome U133A Array平臺(tái)，包含的BC組織樣本和正常乳腺組織均為43例。

1.1.2樣本收集 收集2015年1月—2018年12月乳腺外科30對(duì)BC組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣2～5 cm)，均為女性，36～69歲、平均55.5歲，所有患者均經(jīng)病理學(xué)分析證實(shí)為BC，且為初次診斷。

1.1.3主要試劑及儀器 TRIzol試劑及引物合成(上海生工生物工程有限公司)，PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]，RIPA裂解液、BCA試劑盒及蛋白Marker(北京索萊寶科技有限公司)，兔抗人的11個(gè)關(guān)鍵基因(Hub)基因編碼的蛋白一抗(abcam公司，基因中英文名見(jiàn)表1)，兔抗人GAPDH一抗(沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司)，羊抗兔二抗(Proteintech公司)。普通PCR儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche)，Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、曝光儀[伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1DEGs的識(shí)別 通過(guò)GEO2R篩選和鑒定BC組織和正常乳腺組織之間滿足條件的DEGs，以P<0.05和|log2FC|≥1為截?cái)嘀担渲衛(wèi)og2FC<-1的DEGs認(rèn)為是下調(diào)DEGs，log2FC≥1的DEGs認(rèn)為是上調(diào)DEGs。使用Venn在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對(duì)3個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集中上調(diào)和下調(diào)的DEGs進(jìn)行可視化，并將3者交集部分的重疊DEGs用于后續(xù)分析。

1.2.2DEGs的富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(版本6.8，https://david.ncifcrf.gov/)[5]進(jìn)行基因本體論(gene ontology, GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genome, KEGG)富集分析，了解重疊DEGs的生物學(xué)功能和作用的途徑。通過(guò)EXCEL和R軟件包“ggplot2”對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 11個(gè)Hub基因中英名全稱Tab.1 Identified 11 Hub genes

1.2.3蛋白互作(protein protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊化分析 將篩選出的所有DEGs導(dǎo)入到STRING中進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析，采用Cytoscape (https://cytoscape.org/)軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化后，使用MCODE插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中score>10的模塊，此外，將該模塊中Degree≥10的基因作為后續(xù)研究對(duì)象。

1.2.4Hub基因的生存分析與驗(yàn)證 (1)以Kaplan Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)在線工具為基礎(chǔ)，評(píng)價(jià)Hub基因在BC患者中的預(yù)后價(jià)值，并繪制Kaplan Meier生存曲線；利用基因表達(dá)譜交互分析(gene expression profiling interactive analysis, GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù)從基因?qū)用骝?yàn)證Hub基因在BC組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況，并將結(jié)果顯示在箱線圖中。(2)逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative and reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)驗(yàn)證11個(gè)Hub基因在BC組織和癌旁組織中的表達(dá)：TRIzol法提取BC組織及癌旁組織總RNA，并使用 Nanodrop 2000 進(jìn)行定量及純度測(cè)定，所得RNA均于-80 ℃保存；使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后用于qRT-PCR，所用的引物序列見(jiàn)表2。(3)Western blot驗(yàn)證11個(gè)Hub基因編碼的蛋白在BC組織和癌旁組織中的表達(dá)：RIPA裂解BC組織及癌旁組織并提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；使用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，200 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，使用相應(yīng)的一抗在4 ℃條件下孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后，將二抗于室溫下孵育1 h，孵育完成后TBST洗膜3次進(jìn)行曝光。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

1.2.5Hub基因編碼蛋白的免疫組織化學(xué)分析 (1)利用人類(lèi)蛋白質(zhì)圖譜(the human protein atlas, HPA)數(shù)據(jù)庫(kù)：明確Hub基因編碼的蛋白在BC組織和正常乳腺組織中的表達(dá)，并獲得具有代表性的免疫組織化學(xué)染色圖像。(2)免疫組織化學(xué)染色分析11個(gè)Hub基因編碼蛋白在BC組織和癌旁組織中的表達(dá)情況：將BC組織和癌旁組織用石蠟包埋，制成4 mm厚的切片，將切片脫臘、加熱修復(fù)抗原，使用山羊血清進(jìn)行封閉，一抗4 ℃過(guò)夜、PBS清洗后加二抗37 ℃孵育30 min，使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染30 s使細(xì)胞核顯色、脫水、中性樹(shù)膠封片，最后觀察11個(gè)Hub基因編碼蛋白的表達(dá)。

1.2.6候選化合物的鑒定 將篩選出的DEGs上傳到Cmap數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portals.broadinstitute.org/cmap)。在排列的結(jié)果中，分?jǐn)?shù)從-1～1表示藥物與上傳DEGs之間的相關(guān)性；負(fù)值高的化合物表明其與DEGs的相關(guān)性越高，并且更有可能用于治療[6]。本研究保留P<0.05且值為-0.8～-1的化合物，并將這些化合物導(dǎo)入PubChem Compound網(wǎng)站繪制它們的三維結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用非參數(shù)檢驗(yàn)分析Hub基因或其編碼蛋白在BC中的表達(dá)，Kaplan-MeierPlotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析Hub基因與BC患者預(yù)后的關(guān)系，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選結(jié)果

共篩選出294(110個(gè)上調(diào)、184個(gè)下調(diào))、2 854(1 345個(gè)上調(diào)、1 509個(gè)下調(diào))及818個(gè)(353個(gè)上調(diào)、465個(gè)下調(diào))DEGs，這些DEGs在BC組織和正常乳腺組織中表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A～C)。經(jīng)Venn在線工具取交集，共鑒定出115個(gè)重疊的DEGs，其中26個(gè)上調(diào)、89個(gè)下調(diào)(圖1D～E)。

注：A～C分別為GSE15852(A)，GSE42568(B)和GSE109169(C)的DEGs的火山圖，D～E為3個(gè)數(shù)據(jù)集中重疊DEGs的Venn圖，包括26個(gè)上調(diào)的DEGs (D)和89個(gè)下調(diào)的DEGs (E)。圖1 正常乳腺組織與BC組織中DEGs篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of DEGs in normal breast tissue and BC tissue

2.2 DEGs的功能富集分析

2.2.1分子功能(molecular function, MF) 上調(diào)的基因主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合和染色質(zhì)結(jié)合，下調(diào)的基因主要富集在肝素結(jié)合和酮類(lèi)固醇單加氧酶活性等。

2.2.2細(xì)胞組分(cellular component, CC) 上調(diào)的基因主要涉及紡錘體微管、微管細(xì)胞骨架和核染色質(zhì)等，下調(diào)的基因主要涉及細(xì)胞外間隙和細(xì)胞外基質(zhì)等。

2.2.3生物過(guò)程(biological process, BP) 上調(diào)的基因主要富集在細(xì)胞有絲分裂G2/M期過(guò)渡、DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖的正調(diào)控和有絲分裂姐妹染色單體分離涉及的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等，下調(diào)的基因主要富集在血管生成、磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)的正調(diào)控和肽基酪氨酸磷酸化的正調(diào)控中(圖2A～B)。

2.2.4KEGG pathway結(jié)果 上調(diào)的DEGs富集在2條通路中(P>0.05，圖2C)，下調(diào)的DEGs主要富集在PPAR signaling pathway(hsa03320)、AMPK signaling pathway(hsa04152)和Adipocytokine signaling pathway(hsa04920)等通路中(圖2D)。

注：A～B分別為上、下調(diào)DEGs顯著富集的GO條目，C～D分別為上、下調(diào)DEGs顯著富集的KEGG條目，DEGs為差異表達(dá)基因，GO為基因本體論，KEGG為京都基因和基因組百科全書(shū)。圖2 BC中上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因的GO與KEGG富集結(jié)果Fig.2 GO annotation and KEGG enrichment results of up-regulated and down-regulated DEGS in BC

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與Hub基因的識(shí)別

構(gòu)建115個(gè)重疊DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，共包含115個(gè)節(jié)點(diǎn)和368條邊(圖3A)，此外，識(shí)別了MCODE得分>10的子模塊(圖3B)，該模塊包含20個(gè)點(diǎn)，94條邊。同時(shí)，用模塊中Degree>10的11個(gè)Hub基因繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(表1，圖3C)，并將以上基因作為Hub基因進(jìn)行進(jìn)一步的生存分析。

注：A為3個(gè)數(shù)據(jù)集的DEGs構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡(luò)，B為MCODE得分>10的子模塊，紅色節(jié)點(diǎn)表示上調(diào)的DEGs，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示下調(diào)的DEGs，C為子模塊中Degree>10的Hub基因，DEGs為差異表達(dá)基因，PPI為蛋白互作。圖3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和Hub基因的鑒定Fig.3 Construction of protein-protein interaction network and identification of Hub genes

2.4 Hub基因mRNA和蛋白的表達(dá)及生存分析

與癌旁組織或正常乳腺組織比較，BC組織中上述11個(gè)HubmRNA的表達(dá)上調(diào)，且其編碼的蛋白表達(dá)也上調(diào)，這與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析所得結(jié)果趨勢(shì)一致(P<0.05，圖4A～C)。如圖4D所示，Kaplan-Meier-Plotter分析表明11個(gè)Hub基因均與BC患者的總體生存期(overall survival, OS)相關(guān)(P<0.05)。

注：A為qRT-PCR檢測(cè)EZH2在BC及相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)，B為EZH2的Western blot表征結(jié)果，C為GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中EZH2的表達(dá)，紅色代表BC組織，灰色代表正常乳腺組織，D為EZH2的生存曲線；(1)與癌旁組比較，P<0.05。圖4 BC患者中11個(gè)Hub基因及其編碼蛋白的驗(yàn)證結(jié)果及生存曲線(以EZH2為例)Fig.4 Verification results and survival curves of 11 Hub genes and their encoded proteins in BC patients (take EZH2 as an example)

2.5 Hub基因編碼的蛋白免疫組織化學(xué)分析

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，11個(gè)Hub基因編碼的蛋白在正常乳腺組織中呈現(xiàn)弱染色，而在BC組織中呈現(xiàn)強(qiáng)染色，這與HPA數(shù)據(jù)庫(kù)觀察到的11個(gè)Hub基因編碼的蛋白表達(dá)情況一致(圖5A～B)。

注：A為EZH2免疫組化結(jié)果，B為HPA數(shù)據(jù)庫(kù)所得EZH2的免疫組化結(jié)果；(1)與BC組比較，P<0.05。 圖5 HPA數(shù)據(jù)庫(kù)及免疫組化分析11個(gè)Hub基因的表達(dá)(以EZH2為例)Fig.5 HPA Database and Immunohistochemical analysis of the expression of 11 Hub genes and their encoded proteins(take EZH2 as an example)

2.6 候選化合物的鑒定

基于Cmap數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)，本研究以P<0.05和連接性分?jǐn)?shù)為-8～-1為截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)，共獲得6個(gè)化合物，分別為DL-thiorphan、repaglinide、phenoxybenzamine、cortisone、rottlerin和gliclazide (表3)，這些化合物的負(fù)值較高，提示這些化合物具有逆轉(zhuǎn)BC相關(guān)的DEGs的能力。此外，圖6中展示了這些排名靠前的化合物的3D分子結(jié)構(gòu)示意圖。

表3 Cmap數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別的潛在的具有抗BC功能的化合物Tab.3 Potential compounds with anti-BC function identified by Cmap database

注：A為DL-thiorphan，B為Repaglinide，C為Phenoxybenzamine，D為Cortisone，E為Rottlerin，F(xiàn)為Gliclazide。圖6 Cmap數(shù)據(jù)庫(kù)分析獲得的6個(gè)候選化合物的3D化學(xué)構(gòu)象Fig.6 3D chemical conformation of 6 candidate compounds obtained by Cmap database analysis

3 討論

BC是女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，成為威脅女性健康的“頭號(hào)殺手”，BC的診斷、治療及預(yù)后已成為當(dāng)代學(xué)者研究的熱點(diǎn)。為了解BC患者DEGs的潛在生物學(xué)功能及它們與患者預(yù)后的關(guān)系，本研究利用綜合的生物信息學(xué)分析篩選出115個(gè)重疊的DEGs，其中26個(gè)上調(diào)、89個(gè)下調(diào)。為挖掘DEGs的關(guān)聯(lián)性及其中的Hub基因，本研究進(jìn)行了PPI分析和模塊分析，共獲得11個(gè)Hub基因(SMC4、GINS2、CDC45、EZH2、RRM2、MELK、PRC1、CDK1、HMMR、TOP2A和AURKA)。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析這些Hub基因的表達(dá)差異，通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)它們?cè)贐C中的表達(dá)均上調(diào)，這一結(jié)果與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的趨勢(shì)一致，本研究通過(guò)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)、Western blot和免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步觀察并驗(yàn)證上述基因編碼的蛋白質(zhì)在BC中的表達(dá)，也呈現(xiàn)相同的表達(dá)趨勢(shì)。為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能和作用途徑，本研究通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些重疊的DEGs進(jìn)行GO與KEGG富集分析，結(jié)果表明它們富集的GO條目主要有蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、肝素結(jié)合(heparin binding)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控和血管生成等方面；KEGG pathway分析結(jié)果主要包含p53信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路(hsa03320)和AMPK信號(hào)通路(hsa04152)，研究表明這些通路與BC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[7-9]。以上結(jié)果說(shuō)明DEGs可能通過(guò)這些信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)11個(gè)Hub基因與腫瘤密切相關(guān)，其中EZH2可以調(diào)控蛋白質(zhì)的磷酸化過(guò)程。EZH2是PRC2的核心成分，在早期發(fā)育中具有重要作用，其失調(diào)與各種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，可通過(guò)組蛋白修飾和沉默表觀遺傳基因而促進(jìn)上皮惡性腫瘤[10]。Moore等[11]發(fā)現(xiàn)EZH2通過(guò)磷酸化p38蛋白，促進(jìn)BC轉(zhuǎn)移。Zheng等[12]發(fā)現(xiàn)EZH2在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)的EZH2通過(guò)在pY705位點(diǎn)磷酸化STAT3，減少了FoxO1的表達(dá)，促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲。李朝夕等[13]的結(jié)果顯示EZH2與BC密切相關(guān)，相對(duì)于癌旁組織，EZH2蛋白在BC組織中的表達(dá)上調(diào)，其可能是BC細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子。GO分析表明MELK、CDK1、HMMR和AURKA這4個(gè)基因均與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)，其中，MELK是一種新的癌基因，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶Snfl/AMPK家族中的成員。大量研究表明，MELK是細(xì)胞周期調(diào)控因子，對(duì)有絲分裂過(guò)程至關(guān)重要[14]。Tang等[15]通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)和Western blot發(fā)現(xiàn)MELK可能通過(guò)上調(diào)Twsit1、Slug、MMP7和N-cadherin促進(jìn)肺腺癌的遷移和侵襲，此外，他們還發(fā)現(xiàn)抑制MELK的表達(dá)可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡。CDK1的激活可以磷酸化靶蛋白并產(chǎn)生相應(yīng)的生理效應(yīng)，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞增殖。李振淼等[16]發(fā)現(xiàn)miR-383通過(guò)下調(diào)CDK1等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的增殖。HMMR是一種致癌基因，在多種腫瘤中高表達(dá)，不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，還可以促進(jìn)肺腺癌的轉(zhuǎn)移[17]。AURKA屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，它作為一種致癌基因，在多種癌癥中高表達(dá)，如腎上腺皮質(zhì)癌、肝細(xì)胞癌和前列腺癌等。研究報(bào)道稱AURKA的上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，與膀胱癌的不良預(yù)后相關(guān)[18]。

本研究還發(fā)現(xiàn)GINS2、RRM2和CDC45這3個(gè)基因均與DNA的復(fù)制或修復(fù)相關(guān)。GINS2是GINS復(fù)合物的成員，在DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用[19]。研究報(bào)道稱GINS2在多種侵襲性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，Yu等[20]通過(guò)綜合的生物信息學(xué)分析表明GINS2可作為BC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，這與本研究的結(jié)果一致。RRM2是一種參與DNA修復(fù)和合成的限速酶，在Mazzu等[21]的研究中，他們?cè)谇傲邢侔┘?xì)胞中敲低RRM2，發(fā)現(xiàn)其致癌能力受到抑制，而過(guò)表達(dá)RRM2則促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，此外，他們還在臨床隊(duì)列中證實(shí)了RRM2的高表達(dá)與前列腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。CDC45作為DNA復(fù)制的起始因子，研究表明在非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)中，CDC45的下調(diào)誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞周期阻滯并在體外和體內(nèi)抑制細(xì)胞增殖，它可能是NSCLC中的致癌基因[22]。此外，SMC4、PRC1和TOP2A均被報(bào)道在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)揮重要作用。SMC4是SMC家族中的一員，在細(xì)胞分裂中起著至關(guān)重要的作用[23]，研究表明，SMC4在舌鱗癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌、肝癌和BC等多種癌癥中表達(dá)上調(diào)。鄭世楊等[24]的研究表明敲低SMC4基因的表達(dá)可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，其機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路的激活相關(guān)。PRC1蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，與細(xì)胞的有絲分裂相關(guān)，它被報(bào)道在包括宮頸癌和BC在內(nèi)的多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，且韓兆東等[25]發(fā)現(xiàn)PRC1的高表達(dá)與前列腺癌的惡性程度及患者的預(yù)后相關(guān)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。TOP2A在DNA合成，轉(zhuǎn)錄以及有絲分裂過(guò)程中染色體分離時(shí)起重要作用[26]。TOP2A基因位于17q12-21，其表達(dá)與細(xì)胞增殖[27]和細(xì)胞周期[28]有關(guān)。

由于新藥開(kāi)發(fā)是一個(gè)耗時(shí)、高風(fēng)險(xiǎn)的過(guò)程，在這種情況下，通過(guò)基因表達(dá)譜技術(shù)尋找抗BC的藥物靶點(diǎn)，利用藥物重新定位技術(shù)探索現(xiàn)有藥物的新療效，可成為提高藥物開(kāi)發(fā)投入產(chǎn)出比、降低失敗風(fēng)險(xiǎn)的有效措施[29]。本研究共鑒定了6個(gè)候選的化合物，其中Rottlerin是一種從天然植物中提取的多酚類(lèi)化合物，具有抗腫瘤活性，常用作PKCδ的特異性抑制劑。研究表明抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)的表達(dá)可以抑制癌癥的轉(zhuǎn)移[30]。Lin等[31]發(fā)現(xiàn)使用Rottlerin阻斷PKCδ的表達(dá)可減弱MMP-9的表達(dá)并使細(xì)胞遷移能力減低，從而達(dá)到治療BC的目的。臨床上對(duì)于三陰性BC患者常選擇順鉑作為化療藥物，Pabla在順鉑誘導(dǎo)的腎損傷的研究中發(fā)現(xiàn)Rottlerin可以改善這一現(xiàn)象[32]，該藥是否可用于減弱順鉑對(duì)BC患者所致的腎損傷還有待進(jìn)一步研究。基于這些觀察結(jié)果，本研究認(rèn)為Rottlerin有望成為治療BC的候選化合物。其他5個(gè)化合物在BC中的作用目前尚未報(bào)道，其藥理作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鑒定出的11個(gè)Hub基因可作為BC患者預(yù)后的生物靶標(biāo)，其中GINS2、RRM2和CDK1在DNA復(fù)制中發(fā)揮重要作用，MELK、CDC45、HMMR和AURKA均參與細(xì)胞周期的調(diào)控，SMC4、PRC1和TOP2A在細(xì)胞分裂中發(fā)揮重要作用，Rottlerin有望成為治療BC的候選化合物，但其作用的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。