缺氧條件下‘黃富士’蘋果揮發性成分變化趨勢研究

李恒偉 王慶國

摘要：通過測定‘黃富士蘋果在缺氧條件下揮發性產物含量的變化，分析揮發性成分變化與缺氧傷害的關系，為蘋果低氧傷害的預警，保證氣調貯藏品質提供基礎方法。通過固相微萃取（SPME）技術萃取，采用氣相色譜-質譜寐用技術，對缺氧條件下2、4、6、8、10天揮發物進行成分分析。研究發現，隨著缺氧時間的延長，蘋果中共有18種揮發性成分含量下降，6種揮發性成分上升。篩選出的24種揮發性成分與缺氧傷害存在相關性，可為進一步篩選缺氧預警指標、研究缺氧傷害機理提供參考。

關鍵詞：‘黃富士蘋果;缺氧傷害;揮發性物質;預警指標;氣相色譜-質譜寐用

中圖分類號：TS255.3文獻標志碼：A論文編號：cjas2021-0131

The Changing Trend of Volatile Components in ‘Yellow FujiApple Under Hypoxia Condition

LI Hengwei，WANG Qingguo

（College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271000，Shandong，China）

Abstract：The purpose of this study is to determine the changes in volatile product contents of ‘Yellow Fujiapples under hypoxic condition，analyze the relationship between the changes in volatile components and hypoxia injury，and provide a basic method for early warning of hypoxic injury of apples and ensuring the quality of controlled atmosphere storage. The extraction was carried out with solid phase microextraction （SPME）technology，the analysis of volatile components in 2，4，6，8 and 10 days under hypoxic condition was conducted by using gas chromatography- mass spectrometry technology. The study found that with the prolonged period of hypoxia，the contents of a total of 18 volatile components in apple decreased，and the contents of 6 volatile components increased. 24 volatile components screened out were related to hypoxia injury. The study could provide certain references for further screening of hypoxia early warning indicators and research on the mechanism of hypoxia injury.

Keywords：‘Yellow FujiApple;Hypoxia Injury;Volatile Substances;Warning Indicators;GC-MS

0引言

蘋果（Malus domestica）是國內的大宗果品之一，它營養豐富，具有很強的抗氧化性，有抗癌減脂等功效[1]。目前國內最常見的蘋果貯藏方式為冷庫貯藏與氣調貯藏[2]，低溫環境中蘋果對O₂更敏感，短時條件下低濃度O₂可降低蘋果生理代謝水平，減少乙烯生物合成，延長蘋果采后貯藏期[3]。但長期氣調貯藏中過低的氧分壓易導致缺氧傷害發生，造成蘋果果皮木栓化、果肉組織壞死并伴有濃烈發酵味[4-5]。因此，控制‘富士果實長期氣調冷藏過程中的最適、最低O₂濃度尤為重要[6]。近年來蘋果超低氧氣調逐漸得到應用，但蘋果在多種生理傷害與成熟衰老中乙醇釋放量均會上升，造成難以判斷氣調貯藏氧分壓是否達到蘋果耐受閾值。氣相色譜-質譜聯用分析具有靈敏、快速、簡便、精確等優點，近年來在果蔬揮發性化合物分析領域得到廣泛應用。本研究分析‘黃富士蘋果缺氧氣調過程中揮發性化合物成分的變化，篩選與缺氧傷害存在相關性的物質，旨在為進一步研究缺氧傷害機理提供參考。

1材料與方法

1.1實驗時間、地點

實驗于2020年10—11月在山東省泰安市山東農業大學食品科學與工程學院進行。

1.2實驗材料

‘黃富士蘋果于2020年10月采收自山東省煙臺市，采收后運送至山東農業大學食品科學與工程學院冷庫，回溫48 h后放置于0℃冷庫開始實驗。

1.3儀器設備

美國Mettler Toledo公司ML204電子天平，上海一恒DHG-9240A電熱鼓風干燥箱，德國CNW 20 mL頂空進樣瓶，康寧Exceed-Bc-08艾柯純水儀，日本島津GC2010氣相色譜-質譜聯用儀，美國Supelco 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭，美國Thermo Fisher VF-Wax毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.5 μm），天津森羅氣調貯藏配氣系統，天津森羅50 L水封氣調箱，江蘇賽普公司制氮機，泰安迎春氣體二氧化碳氣瓶。

1.4實驗方法

1.4.1蘋果缺氧氣調處理取30個‘黃富士蘋果，放置于50 L水封氣調箱（于0℃冷庫內放置）中。設定氣調箱氣體濃度為0% O₂、0% CO₂;每隔48 h對箱內揮發性成分進行取樣并測定，重復3次，氣調持續10天。

1.4.2蘋果揮發性物質取樣方法將DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入氣相色譜儀進樣口于250℃條件下老化2 h，老化結束后將萃取頭快速放置于氣調箱內對揮發性氣體成分進行萃取40 min后取出，并插入氣相色譜儀進樣口，于250℃下解吸5 min。實驗重復3次。

1.4.3GC-MS條件使用VF-WAX毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.5 μm），程序升溫為40℃保持3 min，先以6℃/min升至80℃保持1 min，后以6℃/min升溫至110℃保持1 min，再以7℃/min升溫至140℃保持1 min，最終8℃/min升溫至230℃保持5 min。進樣口溫度為250℃，不分流，載氣為氫氣（純度99.999%），柱流量為1.00 mL/min，總流量為14.0 mL/min，離子源溫度210℃，接口溫度230℃，檢測器相對電壓為0.1kV，掃描范圍為33～500 m/z。萃取頭在進樣口脫附時間為5 min。

1.5數據分析

實驗中使用Excel、SPSS等軟件及島津工作站進行數據分析。

2結果與分析

2.1不同傷害時間對蘋果揮發性物質成分的分析

對缺氧傷害條件下的揮發性成分相對含量與絕對含量采用自動積分（Peak Width：4.0 s，Slpoe Sensitivity：100，Peak Size Reject：100）、面積歸一法進行計算，并對各峰質譜圖進行NIST譜庫檢索和人工分析，對不同傷害時間處理后獲得的揮發性氣體樣品進行GC-MS分析。

不同缺氧時間處理‘黃富士揮發性成分如表1所示。實驗共檢測到46種揮發性成分，隨著缺氧氣調時間的延長，香氣成分數量逐漸降低，缺氧氣調10天時樣品中揮發性成分減少為37種。

對表1中各揮發性物質進行分類得表2。隨著缺氧時間延長，酯類、酸類與芳香烴類物質含量逐漸下降，而醇類、醚類和其他揮發性物質隨缺氧傷害加重含量上升。

2.2‘黃富士蘋果缺氧傷害揮發性物質主成分分析

主成分分析是將多個指標化為少數幾個不相關的綜合指標，并對綜合指標按照一定的規則進行分類的一種多元統計分析方法[7]。這種分析方法能夠降低指標維數，濃縮指標信息，將復雜的問題簡化，從而使問題分析更加直觀有效[8]。它也適用于不同氣調時期揮發性物質間的相關依賴性。將‘黃富士蘋果5個不同氣調時期的所有定性大于85%的揮發性化合物進行PCA分析。如圖1所示，第一主成分（PC1）的貢獻率為72.72%，第二主成分（PC2）貢獻率為16.57%，累計貢獻率為89.29%。

由圖1可以發現，在‘黃富士蘋果缺氧傷害中，各揮發性物質在PCA分析中主要聚集為2類。PCA分析中各因子距離越近，表明其相關性越高。1，2，4-三甲基苯、異戊酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸戊酯、乙酸異丁酯、己酸丙酯、乙酸丁酯、丙二醇甲醚、戊酸丁酯、間二甲苯、對二甲苯、丁酸丁酯、丙酸正戊酯、苯甲醛、正己醛、甲苯、2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、己酸異戊酯等18種物質隨缺氧傷害發生存在相關性;丁基呋喃、二丁醚、丁酸丙酯、丙酸正丙酯、丙酮酸乙酯、乙醇等6種物質在缺氧傷害中存在相關性。

2.3相關性物質分析

對主成分分析中篩選出的2類相關性物質進行分析，可以發現2類物質含量分別隨缺氧氣調時間延長而呈現上升和下降趨勢，對各物質分別進行分析并作圖。其中含量隨時間發生突然性上升/下降的物質，其含量劇烈變化可能與缺氧傷害發生相關，并可能作為缺氧傷害預警指標。由圖2可以發現，2-甲基丁酸-2- 甲基丁酯與乙酸異丁酯含量變化相似，均隨缺氧傷害的加重含量下降，其對缺氧傷害存在持續響應且受到傷害抑制，與缺氧傷害存在相關性。

由圖3可知，戊酸丁酯、對二甲苯、間二甲苯、丙二醇甲醚4種物質含量均在缺氧2～4天時下降，6天后物質消失。其成分顯著受缺氧抑制，且隨著缺氧傷害的加重含量迅速降低。

如圖4所示，苯甲醛與甲苯在‘黃富士蘋果香氣中的含量隨缺氧時間的延長而降低。缺氧前6天，其含量逐步下降，隨著缺氧傷害的加重，6天后苯甲醛和甲苯消失。缺氧傷害對苯甲醛和甲苯的產生有明顯抑制作用。

如圖5所示，2-甲基丁酸乙酸酯、2-甲基丁酸戊酯、丙酸正戊酯、己酸丙酯、乙酸丁酯、丁酸丁酯、異戊酸己酯、己酸異戊酯8種酯類在缺氧過程中前6天含量隨時間下降，缺氧6天后含量保持穩定無顯著差異（P<0.05）。8種酯類均在缺氧6天時存在含量變化拐點，與前人研究發現低氧處理抑制脂氧合酶（LOX）活性相互印證[9-12]，說明其受缺氧傷害抑制并與缺氧傷害存在相關性。

如圖6所示，1，2，4-三甲基苯、正己醛在缺氧過程中前6天含量隨時間下降，缺氧6天后含量保持穩定無顯著差異（P<0.05），均在6天時存在含量變化拐點，與缺氧傷害存在相關性。

如圖7所示，丙酸正丙酯、丁酸丙酯、丙酮酸乙酯和二丁醚含量隨著缺氧傷害的加重逐漸上升，其變化趨勢顯然與缺氧傷害存在相關性，可作為缺氧傷害預警指標。

如圖8所示，丁基呋喃在缺氧2天時含量極低，缺氧4天后隨缺氧傷害加重含量快速上升;乙醇含量在缺氧前4天保持不變（P>0.05），4天后含量隨缺氧傷害加重而增加。丁基呋喃和乙醇含量變化與缺氧傷害存在顯著相關性，可作為預警缺氧傷害發生的指標。

3結論

蘋果的香氣是一個較復雜的混合物，由許多具有特征香氣的揮發性物質組成[13-15]。本研究通過GC-MS與固相微萃取技術，對‘黃富士蘋果缺氧氣調過程中揮發性物質進行了鑒定。研究發現，隨著缺氧傷害的加重，酯類、酸類與芳香烴類物質含量逐漸下降，而醇類、醚類和其他揮發性物質含量上升。通過主成分分析與含量變化趨勢分析，篩選出1，2，4-三甲基苯、異戊酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸戊酯、乙酸異丁酯、己酸丙酯、乙酸丁酯、丙二醇甲醚、戊酸丁酯、間二甲苯、對二甲苯、丁酸丁酯、丙酸正戊酯、苯甲醛、正己醛、甲苯、2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、己酸異戊酯、丁基呋喃、二丁醚、丁酸丙酯、丙酸正丙酯、丙酮酸乙酯、乙醇等24種物質與缺氧傷害存在顯著相關性。且相較于乙醇、丙酸正丙酯、丁酸丙酯、丙酮酸乙酯、二丁醚和丁基呋喃對缺氧傷害反應更靈敏，這些物質是進一步分析篩選缺氧傷害發生的預警指標。

4討論

通過GC-MS分析，可有效進行果蔬品種鑒別、生理病害檢測、原產地溯源、風味品質[16]判斷等。在國內，孟志鵬等[17]通過檢測不同品種蘋果揮發性成分差別，找出了‘瑞雪、‘瑞香紅蘋果特征性香氣物質;張虎平等[18]利用代謝組學方法成功建立庫爾勒香梨套袋與非套袋代謝指紋圖譜;邱爽等[19]利用GC-MS與Pearson相關性分析結合產地生態因子，發現了環境因素與櫻桃香氣成分的關系。以上研究均是有效結合氣相色譜-質譜與主成分分析技術，確定揮發性成分與外部因素的相關性。

目前，缺氧脅迫下果實可溶性固形物、有機酸以及酶類活性的變化已有大量研究[20-22]，對缺氧傷害中揮發性物質變化的研究，既有助于改進現代氣調保鮮技術，實現氣調貯藏中氧氣濃度的低限精準控制，提高果蔬氣調效果，分析揮發性化合物的合成代謝通路，也有助于分析和篩選與脅迫有關的候選基因和候選蛋白[23-25]，從分子生物學層面揭示果實應對缺氧脅迫的反應機制。

本研究通過對果實揮發性成分變化與缺氧脅迫間關系分析發現，部分揮發性成分與缺氧傷害存在關系，且找出了可作為缺氧傷害發生預警性指標的揮發性成分。但尚不明確缺氧脅迫對果實揮發性物質合成的分子調控與基因調控機理，對調控機理需做更進一步研究。

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