QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法測定3種β-受體激動劑

◎ 潘 璐，羅詩泳

（1.佛山市南海區里水鎮農林服務中心，廣東 佛山 528000；2.佛山市沃特測試技術服務有限公司，廣東 佛山 528000）

β-型受體激動劑，又稱瘦肉精，是我國動物食品中禁止使用的藥品[1]，其中β2-受體激動劑屬于苯乙胺類藥物，苯環上連接有堿性的β-羥胺側鏈，能與無機酸或有機酸反應生成鹽。按照苯環上的取代基的差異，可將β2-受體激動劑分為苯胺型和苯酚型。苯胺型為中等極性；苯酚型細分為鄰苯二酚型、間苯二酚型和水楊醇型，有較高極性[2]。本文測定的瘦肉精為克倫特羅（苯胺型）、沙丁胺醇（水楊醇型）和萊克多巴胺（間苯二酚型）。

目前的國家標準和行業標準檢測瘦肉精時，動物肌肉組織前處理采用酶水解，正己烷除脂，后用MCX固相萃取柱凈化[3]；或是酶水解與酸水解結合使用，后用HLB固相萃取柱、MCX固相萃取柱凈化[4-5]。這些方法的處理時間長、步驟煩瑣技術要求高，耗材成本也高。QuEChERS凈化法簡化了凈化的流程，操作簡便，但目前國家標準只有在測動物血液和尿液中的瘦肉精殘留量時使用[6]。本文采用酸化乙腈QuEChERS凈化與反萃前處理樣品，液相串聯質譜測定，對克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺3種瘦肉精殘留量進行了方法驗證，探索了在動物肌肉組織中使用酶水解-QuEChERS凈化法測定瘦肉精的可能性。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

高效液相色譜-串聯質譜聯用儀：配有電噴霧離子源（美國ABSciex公司4500型）；氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；高速冷凍離心機（Sigma-Aldrich中國）；電子分析天平（分度值0.01）；食物攪拌機（艾美特電器有限公司）；旋渦混勻器（德國IKA公司）；尼龍針式過濾器（0.22 μm）。

1.2 標準物質與試劑

克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇混合溶液標準物質，濃度均為100 μg·mL-1于甲醇，中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所（農業部農產品質量標準研究中心）提供。

乙腈（色譜純，德國Merck公司），甲酸（色譜純，上海阿拉丁公司），乙酸銨（分析純，上海阿拉丁公司），Bond Elut EMR-Lipid增強型脂質去除凈化管（美國安捷倫公司，貨號5982-1010），Bond Elut dSPE EMR-Lipid Polish反萃管（美國安捷倫公司，貨號5982-0101），水（一級水，Milli-Q制備）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

瘦肉精混合標準系列工作液。分別準確量取適量的瘦肉精混合標準溶液，用50%乙腈溶液逐級稀釋，配制成濃度分別1 μg·L-1、2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1和20 μg·L-1，現配現用[7]。

1.3.2 試劑配制

5%酸化乙腈溶液：將5 mL甲酸加入95 mL乙腈中制得，現配現用；1 mol·L-1乙酸銨儲備液：將19.27 g乙酸銨溶解于250 mL水中，保存在4 ℃冰箱；5 mmol·L-1乙酸銨緩沖液：將5 mL的1 mol·L-1乙酸銨儲備液加入1 L水中，現配現用；50%乙腈溶液：準確移取10 mL乙腈，用水定容至20 mL；流動相A：0.2%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液，將2 mL甲酸和2 mL的1 mol·L-1乙酸銨溶液用水定容至1 L，現配現用；流動相B：0.2%甲酸甲醇，取2 mL甲酸，用甲醇定容至1 L。

1.3.3 樣品前處理

取500 g豬肉樣品，去除筋膜，切小塊，用食物攪拌機打至勻漿。

稱取2 g（精確到0.1 g）豬肉勻漿后樣品，加入10 mL酸化乙腈和陶瓷均質子，渦旋振蕩2 min；以5 000 r·min-1、4 ℃離 心5 min；在Bond Elut EMRLipid增強型脂質去除凈化管中加入5 mL乙酸銨緩沖液和5.0 mL上清液，迅速渦旋震蕩1 min，以5 000 r·min-1、4 ℃離心5 min；取5 mL乙腈上清液加入到Bond Elut dSPE EMR-Lipid Polish反萃管中，迅速渦旋振蕩1 min，以5 000 r·min-1、4 ℃離心5 min；準確吸取離心后的上清液0.2 mL用水定容至1 mL，混合后過0.22 μm尼龍針式過濾器后上機[7-9]。

1.3.4 液相色譜-串聯質譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃，進樣量：2 μL，流速為0.4 mL·min-1；流動相A：0.2%甲酸+2 mmol·L-1乙酸銨水溶液；流動相B，0.2%甲酸甲醇。梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%流動相A，5%流動相B；3.0 min，85%流動相A，15%流動相B；10.0 min，60%流動相A，40%流動相B；18.0～22.0 min，100%流動相B；22.1～26.0 min，95%流動相A，5%流動相B。

離子源：電噴霧離子源（ESI）；電離源極性：正模式；掃描模式：MRM；干燥器溫度：250 ℃；干燥器流速：7 L·min-1；霧化器壓力：241.32 kPa；監測離子，監測離子見表1。

表1 3種瘦肉精監測參數表

2 結果與分析

2.1 結果計算

采用基質匹配標準曲線校準，外標法定量。被測瘦肉精殘留量ω以其在試樣中質量分數計，單位為μg·kg-1，按公式（1）計算。

式（1）中，ρ表示由基質匹配標準曲線查得試樣中瘦肉精的質量濃度，μg·L-1；V1表示提取溶劑總體積，mL；V2表示用于上機檢測的提取溶液的體積，mL；V3表示樣品溶液上機定容體積，mL；m表示試樣的質量，g。計算結果保留3位有效數字。

2.2 線性范圍與檢出限計算

將克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇混合標準品 配 置 成 濃 度 分 別 為1 μg·L-1、2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1和20 μg·L-1的工作溶液。以瘦肉精標準溶液中被測組分的峰面積為縱坐標（Y），標準工作溶液濃度（μg·L-1）為橫坐標（x）繪制校準曲線。計算瘦肉精各組分回歸曲線方程與相關系數，見表2。

根據要求，用信噪比法評估檢出限（LOD），以產生3倍信噪比信號的檢測濃度為檢出限[8]。在陰性豬肉樣品中加入一定量的瘦肉精混合標準工作液，按1.3的步驟處理與測試，根據公式（2）計算方法檢出限。

式（2）中，DL表示方法檢出限，μg·kg-1；N表示背景噪聲峰高；C標表示試樣中添加的瘦肉精混合標準工作液的濃度，μg·L-1；V2表示上機定容體積，mL；V3表示試樣中提取溶劑總體積，mL；V1表示用于上機檢測的提取溶液的體積，mL；H表示已添加瘦肉精混合標準工作液的試樣峰高；M表示樣品稱樣量，g。

2.3 準確度和精密度

準確度是指測得值與真值的符合程度，參照標準要求，本方法準確度用回收率表示，精密度用相對標準偏差（RSD）表示[4]。

取30個各2.0 g的陰性豬肉樣品，參照國標的回收率添加質量濃度，分別添加1.00 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1共3個水平濃度添加標準溶液[4]，每個水平做10個平行[10]。樣品按1.3.2前處理步驟后進行上機測試。分別計算各檢測項目的平均值，平均回收率，相對標準偏差（RSD），計算結果見表3、表4、表5，加標圖譜見圖1。結果表明，克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的回收率在100.2%～110.4%，相對標準偏差在0.7%～3.1%（n=10），滿足標準要求[11]。

表3 克倫特羅回收率和相對標準偏差測定結果表

表4 萊克多巴胺回收率和相對標準偏差測定結果表

表5 沙丁胺醇回收率和相對標準偏差測定結果表

圖1 克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇添加量1.00 μg·kg-1時譜圖

3 結論

本方法采用酸化乙腈提取QuEChERS凈化與反萃前處理樣品，液相串聯質譜測定，對克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺3種瘦肉精殘留量進行測定方法驗證。結果表明，此方法的校準曲線、相關系數、檢出限、精密度、準確度均滿足的要求。