液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水果中吡蟲啉的不確定度評(píng)定

◎ 趙 飛

（遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

不確定度作為評(píng)價(jià)分析結(jié)果準(zhǔn)確性的定量表征，其數(shù)值越小，表明結(jié)果準(zhǔn)確性越高[1]。測(cè)量不確定度的評(píng)定是根據(jù)采用的檢測(cè)方法對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行檢測(cè)所得到的檢測(cè)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)的一種方式，也是評(píng)價(jià)檢測(cè)方法合理性、科學(xué)性的有效手段之一[2]。

吡蟲啉通過作用于昆蟲的乙酰膽堿受體，擾亂神經(jīng)活動(dòng)達(dá)到殺蟲效果，具有觸殺和胃毒雙重作用，應(yīng)用較為廣泛[3]。由于吡蟲啉具有較強(qiáng)的內(nèi)吸作用，不當(dāng)使用后可能造成農(nóng)藥殘留超標(biāo)，給人體健康帶來安全隱患。此外，吡蟲啉對(duì)蜜蜂等傳粉生物具有較大毒性，可嚴(yán)重抑制蜂群數(shù)量的增長(zhǎng)，間接影響環(huán)境生態(tài)平衡[4]。目前，吡蟲啉的檢測(cè)多采用高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中涕滅砜威、吡唑醚菌酯、嘧菌酯等65種農(nóng)藥殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（GB 23200.34—2016）中規(guī)定的方法可一次處理檢測(cè)多種農(nóng)殘，本文按照該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行水果中吡蟲啉的檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)過程的不確定度進(jìn)行系統(tǒng)的分析，為檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室按照該方法開展水果中吡蟲啉檢測(cè)提供科學(xué)的指導(dǎo)與依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Waters XEVO TQD液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世公司）；BSA224S-CW電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；GM200高速粉碎機(jī)（德國(guó)萊馳公司）；FJ300-SH均質(zhì)器（德國(guó)IKA公司）；X1R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司）。

水果購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。丙酮、二氯甲烷、乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，上海安譜公司）；吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度為98.5%，Dr. Ehrenstorfer）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

準(zhǔn)確稱取吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品20.52 mg于20 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即得濃度為1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取0.1 mL濃度為1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈稀釋定容至100 mL，即得1.0 μg·mL-1吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)中間液。基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.0 μg·mL-1）0.25 mL、0.50 mL、1.0 mL、2.5 mL和5.0 mL于50 mL容量瓶中，用5%乙腈定容至刻度，配成標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。準(zhǔn)確移取以上各濃度標(biāo)準(zhǔn)系列工作液1.0 mL分別添加至經(jīng)空白樣品前處理的殘?jiān)校瑴u旋混合均勻，制得5.0 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 儀器條件

色譜柱：WATERS BEH C18，2.1 mm×50 mm；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫程序：A為乙腈，B為0.1%甲酸水；0～0.5 min，A：5%；0.5～2.5 min，A：5%～95%；2.5～3.5 min，A：95%～5%。離子源溫度：150 ℃；檢測(cè)方式：MRM；毛細(xì)管電壓：2.0 kV；脫溶劑氣流量：800 L·h-1；脫溶劑氣溫度：400 ℃；定量離子255.9/174.8；定性離子255.9/208.9；錐孔電壓：34 V；碰撞電壓：12 V/16 V。

1.2.3 樣品制備

稱取10 g試樣，加10 mL水，靜置；再加40 mL丙酮，振蕩提取；上述溶液減壓抽濾，濾液合并濃縮。向濃縮液中加入氯化鈉溶液和二氯甲烷各30 mL，振蕩，移取二氯甲烷層；再向剩余溶液中加入30 mL二氯甲烷，重復(fù)上述操作，合并二氯甲烷層。二氯甲烷層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水，濃縮至近干，加入2.0 mL SPE溶液溶解。將上述溶液轉(zhuǎn)入固相萃取柱（預(yù)先采用SPE溶液淋洗），收集流出液；再用SPE溶液洗滌固相萃取柱，收集流出液；流出液濃縮至近干，氮?dú)獯蹈桑辉偌尤胍欢w積乙腈，再用0.1%甲酸定容至1.0 mL，渦旋混勻，過濾膜待測(cè)。

1.2.4 數(shù)學(xué)模型的建立

建立測(cè)定樣品中吡蟲啉含量的數(shù)學(xué)模型（1）。

式（1）中，ω-樣品中吡蟲啉的含量，μg·kg-1；ρ-由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣液中吡蟲啉的濃度，ng·mL-1；ρ0-空白溶液中吡蟲啉的濃度，ng·mL-1；V-樣品定容體積，mL；c-系數(shù)；A-試樣溶液中吡蟲啉的響應(yīng)值；As-標(biāo)準(zhǔn)溶液中吡蟲啉的響應(yīng)值；m-水果樣品的稱樣量，g；P-水果空白基質(zhì)的加標(biāo)樣品回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評(píng)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度ur(s)

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度ur(c1)。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知，吡蟲啉的相對(duì)不確定度U=1.07%（k=2）。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度ur(c2)。標(biāo)準(zhǔn)品稱量采用分度為0.000 01 g天平，稱量范圍在0～50 g時(shí)，其最大允許誤差為±0.5 mg，按均勻分布計(jì)算，稱量操作過程中由使用的分析天平而引入的相對(duì)不確定度為：

準(zhǔn)確吸取吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL于100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即得1.0 μg·mL-1吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)中間液。

使用0.1 mL的A級(jí)分度吸量管準(zhǔn)確吸取0.1 mL吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容，配制成吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)中間液，其質(zhì)量濃度為1.0 μg·mL-1。該過程的不確定度來源主要由兩方面引入，一方面是使用的吸量管、容量瓶等玻璃器皿本身引入的，另一方面是由于操作時(shí)實(shí)驗(yàn)室的溫度發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致量取的溶液體積變化而引入不確定度。0.1 mL的A級(jí)分度吸量管允許誤差為±0.002 mL，按照均勻分布考慮，則由此引入的不確定度為：

A級(jí)100 mL容量瓶的容量允許誤差為±0.10 mL，按照均勻分布考慮，取則容量瓶引入的不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制室的溫度控制在（20±5）℃，20 ℃下乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3/℃，則由乙腈體積變化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上，標(biāo)準(zhǔn)中間液配制過程引入的不確定度為：

（3）基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度ur(c3)。由基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的各分量相關(guān)情況見表1。

表1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的分量表

根據(jù)各分量，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程引入的 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度ur(c4)。本方法采用優(yōu)化后的儀器條件，分別對(duì)5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，濃度依次為5.0 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1。以吡蟲啉的濃度為橫坐標(biāo)、其響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。向陰性樣品中加標(biāo)，并進(jìn)行6次平行測(cè)定，測(cè)得加標(biāo)樣品的測(cè)試液濃度分別為：45.6 ng·mL-1、45.2 ng·mL-1、45.0 ng·mL-1、45.3 ng·mL-1、45.7 ng·mL-1和45.4 ng·mL-1，平均值為45.4 ng·mL-1，由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度可由公式（2）計(jì)算。

表2 吡蟲啉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線表

式（2）中，u(c4)-曲線擬合引入的不確定度；S(A)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中吡蟲啉響應(yīng)值殘差的標(biāo)準(zhǔn)差；b-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；p-同一溶液測(cè)量次數(shù)（6次）；n-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)（5次）；c0-以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正待測(cè)樣品濃度的平均值，ng·mL-1；ci-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度的理論值，ng·mL-1；c-i-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度的平均值，ng·mL-1。

由基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur(c4)為0.005 42。其中，S(A)可按公式（3）計(jì)算。

式（3）中，Ai-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)的響應(yīng)值；A-以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的理論響應(yīng)值；n-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)數(shù)。

綜上，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為：

2.1.2 樣品稱量引入的不確定度ur(m)

樣品稱量時(shí)采用分度為0.01 g的分析天平。0～50 g稱量范圍內(nèi)該天平的最大允許誤差為±0.05 g，按均勻分布，由樣品稱量操作過程引入的相對(duì)不確定度為：

2.1.3 樣品前處理引入的不確定度ur(V)

提取過程中凈化后加入0.4 mL乙腈，再加入0.6 mL 0.1%甲酸水溶液。分別采用0.5 mL、1 mL分度吸量管進(jìn)行添加，容量允差分別為±0.005 mL、±0.008 mL，該過程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.4 重復(fù)性引入的不確定度ur(R)

按照實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，添加量為5 μg·kg-1，測(cè)定值分別為：4.56 μg·kg-1、4.52 μg·kg-1、4.50 μg·kg-1、4.53 μg·kg-1、4.57 μg·kg-1和4.54 μg·kg-1，加標(biāo)測(cè)試樣品的平均測(cè)定值為4.54 μg·kg-1，采用貝塞爾公式計(jì)算待測(cè)物的實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.005 69，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.1.5 回收率引入的不確定度ur(P)

對(duì)陰性水果樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，添加量吡蟲啉的量相當(dāng)于5 μg·kg-1，回收率分別為：91.2%、90.0%、90.6%、91.4%、90.8%和90.4%，平均值為90.7%，按照A類評(píng)定應(yīng)用貝塞爾公式計(jì)算待測(cè)物的實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.569%，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

采用t檢驗(yàn)方法來判斷本實(shí)驗(yàn)的回收率同100%之間是否存在顯著差異，若存在，需要采用回收率對(duì)結(jié)果進(jìn)行修正。當(dāng)n=6，在95%置信概率水平下t0.95(5)=2.571，該回收率下即t＞2.571，即檢測(cè)結(jié)果需采用回收率進(jìn)行修正。

本實(shí)驗(yàn)中，由回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2 合成不確定度

綜合以上各分量，吡蟲啉的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算如下：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u(x)=0.026 2×4.54=0.12 μg·kg-1。

2.3 擴(kuò)展不確定度和結(jié)果表示

當(dāng)置信概率在95%時(shí)，吡蟲啉檢測(cè)結(jié)果的擴(kuò)展不 確 定 度為U95=k×u(x)=0.24 μg·kg-1（k=2）。按照《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）要求，采用本方法檢測(cè)樣品中吡蟲啉的含量，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)表示為（4.54±0.24）μg·kg-1。

3 結(jié)論

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水果中吡蟲啉含量，對(duì)整個(gè)操作過程中存在的不確定度分量進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)定。通過評(píng)定可以看出，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行水果中吡蟲啉檢測(cè)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制引入的不確定度貢獻(xiàn)最大，回收率和樣品稱量引入的不確定度貢獻(xiàn)次之。因此，今后的工作中，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制時(shí)應(yīng)通過更合理地設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，選用合適的移液工具，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)室的溫度，提高檢測(cè)人員的技術(shù)水平，切實(shí)減小不確定度分量，保證檢測(cè)數(shù)據(jù)的科學(xué)性和合理性。