天然木脂素苷類成分eleutheroside E對膝骨性關節炎的治療作用及其與MMPs相互作用方式的分析

閆兆威，張 敏，魏明剛，姚 鑫，劉江云

1蘇州大學附屬第一醫院，蘇州 215006；2蘇州大學藥學院，蘇州 215123

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性疾病，主要表現為關節軟骨代謝異常和關節骨結構破壞，嚴重時會導致關節功能喪失，已成為50歲以上人群喪失勞動力和致殘的重要病因。其中膝骨性關節發生率最高，據世界衛生組織統計，目前全世界約有1.9億骨性關節炎患者，隨著老齡化社會的進程，OA患者逐年增多，給患者家庭帶來了極大的經濟負擔和精神壓力[1,2]。目前對OA的治療是以一些非特異性藥物減輕臨床癥狀為主，通過口服非阿片類止痛藥(對乙酰氨基酚、中樞鎮痛藥)及非甾體類抗炎藥來緩解關節炎患者的癥狀，但并不能從根本上治愈OA，同時該類藥物在心血管系統及胃腸道系統的不良反應較多，限制了其應用的范圍[3,4]。因此，臨床上亟待開發一種具有新作用機制、強效的OA治療創新藥物。Eleutheroside E(EE)是刺五加中特有的木脂素苷類成分(圖1)，課題組在前期研究發現EE具有較好的抗炎作用[5,6]，但目前為止，國際尚未見有關EE在OA治療應用的研究報道。故本研究基于前期工作基礎，采用前交叉韌帶切斷法(ACLT)建立兔膝骨關節炎模型，首次選用EE作為治療藥物，通過關節腔注射的方式給藥進行治療干預，從動物整體水平對EE在實驗性兔膝骨性關節炎的治療及保護作用進行評價。并進一步運用分子對接技術和分子動力學模擬手段對EE與MMPs相互作用的位點及結合方式進行分析，明確EE與MMPs復合物結合的模式，從而為研發一種天然來源新型的骨性關節炎候選治療藥物奠定基礎。

圖1 Eleutheroside E的化學結構式Fig.1 The chemical structure of eleutheroside E

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

Eleutheroside E(EE，含量≥ 98%，批號：20130811)購于成都瑞芬思生物科技有限公司，塞來昔布(celecoxib，含量≥ 98%，批號：20131019)購于Sigma-Aldrich公司，放于4 ℃冰箱保存，現用現配。MMP-3(批號：20140212)，MMP-9(批號：20140417)和IL-1β(批號：20140130)的ELISA試劑盒購于TSZ Scientific LLC公司；PGE2(批號：20140625)的ELISA試劑盒購于R&D Systems公司。

1.2 儀器

EL104型電子天平(上海越平科學儀器有限公司)；3K15型臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；Sunrise型酶標儀(瑞士Tecan公司)；BX41型光學顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)。

1.3 實驗動物

新西蘭大白兔，30只，雄性，體重3.0～3.5 kg，清潔級，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號(SCXK(滬)2012-0002)。試驗期間飼養室溫度20～24 ℃，相對濕度為65～75%，自由攝食和飲水，實驗動物處理遵守實驗動物倫理原則。

1.4 實驗方法

1.4.1 OA動物模型建立及藥物處理

取30只雄性的健康新西蘭大白兔，體重3.0～3.5 kg，清潔級，隨機分為5組，每組6只，分為假手術組(sham operation，SO)、模型組(model)、EE低劑量(20 mg/kg，EE-20)、EE高劑量(60 mg/kg，EE-60)治療藥物組、陽性對照藥celecoxib(15 mg/kg，Cel-15)組。所有動物造模前一天右膝備皮，術前稱重，用10%水合氯醛按300 mg/kg經腹腔注射麻醉，將動物仰臥位固定于手術臺上，消毒鋪單。假手術組僅做皮膚切口，不切斷前交叉韌帶。模型組和各治療組的動物均采用文獻報道的前交叉韌帶切斷法(ACLT)建立骨性關節炎動物模型[7]。具體操作步驟如下，取髕骨內側切口，顯露關節腔，切斷前交叉韌帶，并切除斷端1～2 mm，防止術后粘連，術中注意保護關節軟骨，逐層縫合切口，術后3天肌肉注射青霉素，40萬U/d。各組實驗動物四周后觀察切口愈合良好后，再進行關節腔注射給藥，每次注射藥物體積為0.5 mL，每周給藥1次，連續進行5周。治療藥物EE組，關節腔注射給予EE-20和EE-60兩種劑量；陽性藥物組，關節腔注射給予Cel-15；模型組僅注射給予空白溶媒生理鹽水0.5 mL；藥物在注射前用生理鹽水溶解，現用現配，假手術組不予任何處理正常飼養。

1.4.2 大體觀察

處死動物取材時，觀察右膝關節的關節面是否光澤，有無軟化灶、糜爛、潰瘍和缺損，有無軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露，關節局部有無骨贅形成。并用大體評分規則進行評估[8]：0分：關節面光滑，色澤正常；1分：關節面粗糙，有小的裂隙，色澤灰暗；2分：關節面糜爛，軟骨缺損達軟骨表層或中層；3分：關節面潰瘍形成，缺損達軟骨深層；4分：軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露。

1.4.3 組織病理學觀察

采用空氣栓塞法處死各組實驗動物后，矢狀位切取右膝關節，股骨內側骼負重部分標木，厚約0.5 cm，包括關節軟骨和軟骨下骨，置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，10% EDTA脫鈣，酒精脫水，透明、浸蠟，5 μm層厚連續切片，烤片1 h，脫蠟、水化，HE染色，脫水、透明，中性塑膠封片。光學顯微鏡下觀察關節軟骨結構是否清晰，軟骨細胞排列是否整齊，有無軟骨細胞增生、缺失，有無軟骨裂隙、潰瘍及缺損、軟骨層纖維成分是否增多等病理改變情況。觀察滑膜組織有無肥厚及增生，有無血管侵入，有無炎細胞浸潤等情況[9]。根據骨關節病組織分類方法中關節軟骨與滑膜的病變計分標準[10]，對各組動物膝關節標本的病變程度進行計分和組間比較。

1.4.4 關節液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9的水平測定

實驗結束后，處死兔子取關節液，測定關節液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9的水平，所有檢測實驗均按照ELISA試劑盒的使用說明書進行操作。

1.4.5 分子對接實驗

采用Chemdraw 15.0繪制小分子EE的2D結構，保存為cdx格式。載入Chem3D 15.0，用MM2力場進行能量最小化，保存為pdb格式。載入Autodocktool 1.5.6程序，添加電荷，分配原子類型，所有可旋轉鍵均設置為柔性，保存為pdbqt格式，用于分子對接。以MMP-3(PDB ID：1B8Y)和MMP-9(PDB ID：1GKC)晶體結構作為蛋白受體，進行分子對接。在Pymol 1.7程序中刪除晶體結構中的結晶水和其他小分子，添加氫原子后保存。載入Autodocktool 1.5.6程序，添加電荷，分配原子類型，保存為pdbqt格式，作為分子對接受體。采用Vina 1.1.2軟件進行分子對接，獲取配體-受體復合物初始坐標，選取affinity最佳構象作為分子對接結果。

1.4.6 分子動力學模擬

采用Amber 18軟件包對蛋白-小分子復合物進行分子動力學模擬。蛋白使用ff14SB力場參數，小分子配體則使用gaff通用力場參數，并使用ANTECHAMBER 模塊計算其AM1-BCC原子電荷。將蛋白-小分子復合物載入tleap模塊，自動添加氫原子和拮抗離子以中和電荷。選擇TIP3P顯性水模型，設置周期性邊界條件。分子動力學模擬工作流程共包括能量最小化、加熱、平衡、生產動力學模擬等4步。首先，約束蛋白(和小分子)重原子，對水分子進行10 000步(含5 000步最速下降法和5 000步共軛梯度法)能量最小化；隨后，在50 ps時間內，將體系緩慢加熱至300 K；加熱完成后，在npt系綜下對體系進行50 ps的平衡。最后，將體系在npt系綜下進行50 ns的分子動力學模擬。每隔10 ps保存一次軌跡數據，并用CPPTRAJ模塊進行相關分析。配體和蛋白的結合自由能計算則采用MMPBSA.py模塊進行。

1.4.7 數據分析

采用SPSS 16.0統計軟件處理系統，實驗數據以平均值±標準誤差表示，統計分析采用Mann-Whitney U 檢驗，P<0.05有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 EE對兔子大體觀察的影響

假手術組顯示：軟骨面完整光滑，色澤正常，無關節積液及滑膜增生。模型組顯示：軟骨剝脫，軟骨下骨暴露，股骨外髁有明顯骨贅及潰瘍生成。EE-20、EE-60和Cel-15治療組中顯示：關節軟骨表面欠光滑，有散在潰瘍點，軟骨邊緣無骨贅形成，未見裂紋及軟化灶，大體破壞程度明顯降低，其中EE-60和Cel-15治療組與模型組比較，治療效果明顯(P<0.001)。EE治療后代表性股骨外髁圖及各組的大體評分見圖2所示。

圖2 EE對兔子大體觀察的影響Fig.2 Effect of EE on macroscopic observations of rabbits注：與假手術組比較，### P < 0.001；與模型組比較，* P<0.05,*** P<0.001。Note:### P<0.001 vs SO group;*P<0.05,*** P<0.001 vs model group.

2.2 EE對兔子膝關節病理觀察的影響

關節軟骨HE染色結果：假手術組中顯示：動物軟骨表層完整，軟骨結構清晰可辨，細胞排列整齊，潮線結構完整；模型組中顯示：軟骨表層剝脫，細胞明顯增生，排列嚴重紊亂，潮線結構破壞。Cel-15治療組顯示：軟骨病變程度較輕,表面光滑，但仍可見軟骨表層細胞的染色加深及細胞排列紊亂；EE-20和EE-60治療組顯示：軟骨表層輕微破損，可見一定程度的表層細胞增生，部分細胞的染色加深等軟骨病變，但與模型組比較有明顯的改善。EE治療后代表性關節軟骨病理圖片及各組關節軟骨的病理評分見圖3所示。

圖3 EE對兔子關節軟骨組織病理學的影響(HE,×100)Fig.3 Effect of EE on histopathology of articular cartilage of rabbits(HE,×100)注：與假手術組比較，###P<0.001；與模型組比較，*P<0.05,***P<0.001。Note:###P<0.001 vs SO group;*P<0.05,***P<0.001 vs model group.

滑膜HE染色結果：假手術組中顯示：滑膜織無肥厚及增生，無血管侵入，無炎細胞浸潤；模型組中顯示：滑膜內襯細胞增生，排列雜亂，毛細血管及纖維組織增生，大量炎癥細胞浸潤。EE-20和EE-60治療組中顯示：滑膜細胞數量較模型組減少，輕度纖維組織增生，少量炎證細胞浸潤。EE和Cel-15治療組與模型組比較，治療效果明顯(P<0.001)。EE治療后代表性滑膜組織病理圖片及各組滑膜的病理評分見圖4所示。

圖4 EE對兔子滑膜組織病理學的影響(HE,×100)Fig.4 Effect of EE on histopathology of synovial membrane of rabbits(HE,×100)注：與假手術組比較，###P<0.001；與模型組比較，***P<0.001。Note:###P<0.001 vs SO group;***P<0.001 vs model group.

2.3 ELISA法測定EE對關節液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9水平的影響

取兔子的關節液，采用ELISA檢測方法，對關節液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9的水平進行測定。檢測結果分析顯示：模型組動物關節液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9的含量水平明顯高于假手術組(P<0.001)；EE-20、EE-60 mg/kg和Cel-15治療組與模型組比較，均能明顯降低關節液中IL-1β、PGE2、MMP-3和MMP-9的水平，其中EE-60和Cel-15治療組與模型組比較，抑制作用顯著(P<0.001)，見圖5A～D。

圖5 EE對關節液中IL-1β(A)、PGE2(B)、MMP-3(C)和MMP-9(D)水平的影響Fig.5 Effect of EE on the levels of IL-1β (A)、PGE2 (B)、MMP-3 (C) and MMP-9 (D) in synovial fluid 注：與假手術組比較，###P<0.001；與模型組比較，***P<0.001。Note:###P<0.001 vs SO group;***P < 0.001 vs model group.

2.4 分子對接結果分析

分子對接實驗顯示，EE配體可結合于MMPs催化位點的凹槽中，并獲得了對接的最佳構象，其中EE與MMP-3對接的最低自由能值為-8.2 kcal/mol；EE與MMP-9對接的最低自由能值為-7.5 kcal/mol，見圖6所示(中心位置顯示的紫色圓球為催化必須的Zn離子)。

圖6 分子對接最佳構象示意圖Fig.6 Optimal conformation of molecular docking注：Zn離子由紫色圓球表示。A.EE與MMP-3對接的最佳構象；B.EE與MMP-9對接的最佳構象。Note:Zn ions are represented by purple spheres.A.Optimal conformation of molecular docking between EE with MMP-3;B.Optimal conformation of molecular docking between EE with MMP-9.

同時，EE配體糖環上的多個羥基可與MMP-3和MMP-9受體中的多個氨基酸(如His201側鏈N、Ala189骨架N、Ser412骨架O、His411骨架O等)形成氫鍵，這些氫鍵對于配體的結合起到重要作用。此外，EE配體苯環可與MMP-3中(Tyr155、Phe86、Tyr168、Phe210、Val163)和MMP-9中(Leu188、Val398、Tyr423、Tyr420、Leu187)等疏水殘基形成疏水堆積作用，亦可穩定其結合，見圖7所示。

圖7 EE與MMP-3(A)和MMP-9(B)殘基間的相互作用圖Fig.7 Interaction of EE with the active site residue of MMP-3 (A) and MMP-9 (B)

2.5 分子動力學模擬結果分析

進一步應用AmberTools 18.0軟件進行分子動力學模擬實驗，采取rmsd平衡之后的軌跡，基于MMGBSA方程計算配體EE與MMP-3和MMP-9的結合自由能。實驗結果顯示(見表1)：EE與MMP-3的總結合自由能為-19.8 kcal/mol，EE與MMP-9的結總合自由能為-15.2 kcal/mol，相比較而言，EE與MMP-3的總結合能更低，表明EE與MMP-3結合能力更強，此結果與上述ELISA檢測實驗結果趨勢基本一致。其中，在EE與MMP-3和MMP-9復合物結合的過程中，主要的貢獻來源于范德華勢能和靜電作用，且兩個體系具有相似的結合模式。此外，在整個分子動力學過程中，蛋白回旋半徑曲線均較為平穩，穩定在15?附近，蛋白整體結構緊湊，不存在松散、去折疊等情況。

表1 EE與MMP-3和MMP-9結合自由能分析Table 1 Binding free energy analysis of EE binding to MMP-3 and MMP-9

3 討論與結論

關節軟骨的基本組成成分為軟骨基質、軟骨細胞和水。軟骨基質主要由蛋白多糖和膠原組成，軟骨細胞是軟骨基質分解代謝反應的主要來源，在正常的生理條件下，軟骨成分的降解與合成之間保持動態平衡。骨性關節炎(OA)病變的發生主要是由于一些相關介質或因子引起了關節組織的骨、軟骨、甚至關節內韌帶和肌腱的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)進行性破壞，導致關節軟骨局部軟化、磨損及結構損壞[11]。近年來有學者發現基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與OA患者的骨關節損傷及病情活動密切相關，在關節軟骨基質及軟骨細胞破壞的病理過程中起著非常關鍵的作用[12]。MMPs是一種能夠降解細胞外基質(ECM)的鋅蛋白水解酶，幾乎能降解ECM的所有成分，在骨性關節炎發生過程中，軟骨細胞及滑膜細胞分泌過量的基質金屬蛋白酶(MMP-3和MMP-9)[13]，打破了基質金屬蛋白酶-基質金屬蛋白酶組織抑制因子(MMP-TIMP)的平衡，使ECM發生了不可逆的降解，導致關節軟骨的腫脹、抗外力作用下降、關節內炎癥反應加重，最終致使關節功能的喪失[14]。

MMPs過量表達導致的軟骨破壞已經成為研究OA發病機理的熱點之一，因此通過尋找MMPs抑制劑成為治療OA藥物研發的新策略。

中藥是祖國醫藥寶庫中的重要組成部分，由于其來源廣泛、化學成分豐富、不良反應少，開發成新藥易于人體接受的特點，越來越受到國內外研究學者的關注，目前嘗試從中藥篩選發掘針對疾病靶標的新型小分子治療藥物已經成為研究熱點[15,16]。刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.) Harms又名五加參、刺拐棒，是一種名貴的藥用植物，主產于中國的黑龍江、吉林、遼寧、河北、俄羅斯遠東地區及日本北海道等地，在我國有著悠久的藥用歷史[17]。課題組前期研究發現eleutheroside E(EE)是刺五加中主要活性成分之一[18]，目前關于EE的藥理作用報道不多，主要為降低血糖、改善絕經后骨質疏松、抗中樞疲勞及記憶缺損、降低腦缺血再灌注損傷等方面[19-22]。我們前期研究發現EE可以明顯抑制炎癥因子和關節軟骨破壞的情況，經文獻檢索調研，截至目前國際尚未見有關EE在OA治療應用的研究報道。

因此，本文首次對EE治療骨性關節炎作用進行了研究，從動物整體水平對EE在實驗性兔膝骨性關節炎的治療及保護作用進行評價，從而為EE防治骨性關節炎提供實驗依據。本研究采用經典的前交叉韌帶切斷法(ACLT)建造兔膝骨性關節炎模型，通過關節腔注射的方法注射給予EE-20和EE-60進行治療干預，每周給藥1次，連續給藥5周，研究其對兔膝骨關節炎模型的炎癥細胞因子等指標以及關節病理學改變的影響，觀察EE對兔膝骨關節炎動物模型的防治作用。實驗結果顯示EE能明顯改善骨關節炎部位炎細胞浸潤、纖維組織增生及軟骨表層破壞等情況。有研究表明：MMP-3和MMP-9可以加快OA關節軟骨結構中細胞外基質的損害，促進軟骨破壞的速度，從而推進OA的進展過程。此外,IL-1β也是導致OA產生的關鍵因素，IL-1β可誘導滑膜細胞一氧化氮(NO)、環氧化酶(COX)的產生，而環氧化酶2又能夠促進一氧化氮、前列腺素E2(PGE2)的分泌，而PGE2是一種多效性炎癥介質，它能夠增加MMPs和其他分解代謝物質的產生從而影響關節組織結構和功能，進而加速關節結構的破壞[23,24]。因此，我們進一步采用ELISA檢測方法，對EE干預后OA模型動物關節液中炎癥介質(IL-1β和PGE2)以及基質金屬蛋白酶MMP-3和MMP-9的水平進行分析測定。結果顯示：EE治療干預后可以明顯降低關節液中炎癥介質(IL-1β和PGE2)以及基質金屬蛋白酶MMP-3和MMP-9的水平(P< 0.001)，表明EE具有明顯抗骨性關節炎的作用。

目前，分子對接技術和分子動力學模擬已成為探索蛋白與受體結合方式的重要工具，在新藥研究領域中具有的重要應用價值[25]。本研究進一步運用分子對接技術及分子動力學模擬手段，對EE與MMPs相互作用位點和結合方式進行了分析和探討。研究結合于MMP-3和MMP-9催化位點的凹槽中，EE糖環上的羥基可與MMP-3和MMP-9受體中的氨基酸形成氫鍵，這些氫鍵對于配體的結合起到了重要作用。此外，EE配體苯環亦可與MMP-3和MMP-9中的疏水殘基形成疏水堆積作用，亦可穩定其結合。分子動力學模擬實驗表明，EE與MMP-3和MMP-9復合物結合過程中，主要貢獻來源于范德華勢能和靜電作用，且兩個體系具有相似的結合模式。其中，EE與MMP-3的總結合能更低，相比較而言，EE與MMP-3結合能力更強，此結果與上述ELISA檢測實驗結果的趨勢基本一致。以上數據為今后研究EE抗MMPs的分子作用機制以及開發木脂素苷類母核結構新型MMPs抑制劑提供了關鍵的理論依據。

綜上所述，關節腔注射EE可以明顯改善骨關節炎部位炎細胞浸潤、纖維組織增生及軟骨表層破壞等情況，并降低關節液中炎癥介質(IL-1β和PGE2)以及基質金屬蛋白酶MMP-3和MMP-9的含量水平，表明EE具有明顯抗骨性關節炎的作用。此外，進一步的分子對接技術和分子動力學實驗發現，EE配體可結合于MMP-3和MMP-9催化位點的凹槽中，EE配體糖環上的多個羥基可與MMP-3和MMP-9受體中的多個氨基酸形成氫鍵，這些氫鍵對于配體的結合起到重要作用。本研究結果將為研發一種天然來源新型的骨性關節炎候選治療藥物奠定了基礎。