無花果葉片多糖抑制胃癌細胞增殖與促進凋亡效應

鄧佳麗，李 曉，安玉艷，林澤崑，汪良駒,2*

1南京農業大學園藝學院，南京 210095；2青島海德坤生物科學研究院，青島 266200

無花果(FicuscaricaL.)屬于桑科榕屬，是一種常見的暖溫帶落葉果樹，也是人類馴化栽培最早的果樹之一[1]。1990年，南京農業大學與江蘇省腫瘤防治研究所合作研究證明，無花果具有明顯的抗癌效應[2]，全國性的無花果產業開始蓬勃發展起來。現在，無花果除了加工成果酒、果干、果醬等食品外，其醫藥保健特別是抗癌藥用仍然像謎一樣吸引人們[3]。只有把這種價值開發利用起來，這種古老的果樹才能真正造福于人類。

無花果富含多種醫藥活性成分，如黃酮[4]、苯甲醛[5]、多糖等[6]，其根、莖、葉、果、乳汁均可納入傳統藥源。許多研究者致力于從植物中提取天然多糖，認為它們具有提高免疫活性[7]、降血糖[8]、抗腫瘤[9]等醫療功效。在無花果上，也有學者把其抗癌活性歸結為多糖組份，在Guo等[10]報道中，無花果果實多糖具有抗氧化活性，且能顯著抑制人體肝癌HepG2和胃癌SGC-7901細胞生長。Jiang[11]證實，無花果葉片多糖對人體肺癌細胞A549、宮頸癌細胞Hela、肝癌細胞HepG2均有不同程度的抑制效果。因而，無花果多糖可望用于人體腫瘤防治。但是，無花果品種眾多，特性各異，是不是所有品種多糖都具有抑癌活性，需要試驗判明。另外，無花果葉片大，數量多，可以制作無花果茶[12]。但是，無花果茶品制作及飲用過程，主要考慮的是口感，很少涉及多糖在人體保健中作用。實際上，經高溫熱水浸泡的無花果茶湯含有一定量多糖。這是無花果產品開發中有待探討的問題。前人對無花果多糖的研究多集中于果實，對葉片多糖研究尚少。不同品種間葉片多糖抑癌活性未見報道。為此，本試驗首先分離提取純化三個不同品種不同月份無花果葉多糖，然后，利用MTT法比較了不同來源多糖對人體胃癌SGC-7901細胞增殖的抑制活性，并在此基礎上進一步研究無花果葉多糖對癌細胞凋亡效應和機理，以期為無花果品種葉片綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

無花果品種由南京農業大學園藝學院汪良駒教授鑒定。2019年7月至11月間，每月于江蘇省常州市圣王果蔬有限公司無花果園采摘‘布蘭瑞克’和‘瑪斯義陶芬’新梢中部成熟葉片，南京市浦口區翔辰家庭農場無花果園采摘‘波姬紅’葉片。洗凈后，在110 ℃烘箱中殺青10 min，在80 ℃條件下烘干，磨碎成粉，過60目篩，以備多糖提取之用。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培養基(Lot No:AF29546226)、1×PBS緩沖液(Lot No:AF29511325)為Hyclone公司產品；胎牛血清FBS(Lot No:2232246)和0.25%胰蛋白酶(Lot No:2120734)來自Gibco公司；細胞培養級別二甲基亞砜DMSO(Lot No:1209M0312)、MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)細胞增殖抑制試劑盒(Lot No:20200728)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Lot No:20200825)、細胞周期DNA含量檢測試劑盒(Lot No:20200728)、活性氧ROS檢測試劑盒(Lot No:20201123)來自北京索萊寶生物科技有限公司；RNA simple Total RNA Kit試劑盒來自天根生化科技有限公司；cDNA反轉錄試劑盒(Lot No:G492)來自ABM公司。

1.2.2 儀器

CO2培養箱(Thermo Electron Corporation)；實時熒光定量PCR儀(Thermo Electron Corporation)；倒置顯微鏡(Leica)；流式細胞儀(BD Accuri C6 Ⅱ)；多功能酶標儀(BioTek)；高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 多糖制備與精制

取無花果葉干粉1 kg，按1∶15物液比添加去離子水，在80 ℃熱水中浸提8 h。真空抽濾收集濾液。經旋轉蒸發濃縮后，添加無水乙醇，使乙醇濃度調至75%。4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，得到粗多糖。而后，經AB-8大孔樹脂和Sevage法脫色除蛋白，3 kD透析袋透析，去除小分子寡糖，保留10個以上單糖組成的多糖，冷凍干燥成固體備用。

1.3.2 細胞培養

人體胃癌SGC-7901細胞由中國藥科大學倪孟祥教授提供，培養于含10%FBS的RPMI培養基上，置于37 ℃、5%CO2恒溫箱中。

1.3.3 無花果葉多糖對SGC-7901細胞增殖抑制影響

1.3.3.1 多糖品種月份篩選

取對數生長期細胞溶液(濃度為1×105/mL)100 μL加到96孔板中，培養4 h至細胞貼壁，棄上清液。將不同品種不同月份的無花果葉精制多糖(2 mg/mL)溶液添加到細胞培養基，繼續培養48 h。棄除培養基后，加入90 μL新鮮培養基和10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，再培養4 h。棄除孔內溶液后，加入110 μL DMSO，水平晃動10 min，使晶體充分溶解，在酶標儀490 nm處測定吸光度，以(1-OD樣品/OD空白)×100%作為癌細胞增殖抑制率。該試驗生物學重復3次以上。

1.3.3.2 多糖濃度篩選

將無花果多糖濃度設置為0.5、1、2、4 mg/mL，按照上述方法測定不同濃度多糖對胃癌細胞SGC-7901增殖抑制率。

1.3.4 細胞形態觀察

將SGC-7901細胞均勻鋪在6孔板中，用不同濃度多糖處理，培養48 h后在倒置光學顯微鏡(10×物鏡)下觀察SGC-7901細胞形態變化。

1.3.5 細胞周期分析

收集多糖處理48 h后的培養細胞，用PBS洗滌，經300 g離心5 min，去除上清液，再用PBS將細胞濃度調整為1×105/mL，加入體積分數為70%預冷乙醇500 μL固定，4 ℃過夜。染色前用PBS洗去固定液，250 g離心3 min。在細胞沉淀中加入100 μL RNase A 溶液，充分混勻，37 ℃水浴30 min。再加入400 μL PI染色液混勻，4 ℃避光孵育30 min后使用流式細胞儀在激發波長488 nm紅色熒光下檢測20 000以上細胞的細胞周期，用Flow Jo分析不同階段細胞比例[13]。

1.3.6 細胞凋亡檢測

收集多糖處理48 h的培養細胞，用預冷的PBS洗滌，300 g離心5 min，棄上清。用1 mL Binding Buffer(1×)懸浮細胞，300 g離心10 min，棄上清。用Binding Buffer重懸細胞，使細胞濃度達到1×106個/mL。吸取100 μL重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC溶液，混勻后在室內避光處孵育10 min。加入5 μL PI，再孵育5 min。加入PBS至500 μL，輕輕混勻，在流式細胞儀激發光波長488 nm、發射波長515 nm的通道中檢測FITC，在發射波長560 nm的通道中檢測PI。每次檢測10 000個細胞，Flow Jo分析細胞凋亡情況。

1.3.7 細胞活性氧(ROS)含量檢測

收集多糖處理48 h后的培養細胞，離心去除培養液，按照1∶1 000比例，用無血清RPMI培養液稀釋10 mmol/L的熒光探針DCFH-DA，使熒光探針最終濃度為10 μmol/L。向細胞溶液中加入1 mL稀釋后的DCFH-DA溶液，充分混勻，在細胞培養箱中孵育25 min。此期，每隔5 min顛倒混勻，使細胞與探針充分接觸。之后，用無血清培養基洗滌，以去除未進入細胞中的探針。最后，將裝載好探針的細胞置于流式細胞儀上在激發光波長500 nm，發射波長為525 nm的通道中收集10 000個細胞，Flow Jo分析細胞熒光強度。

1.3.8 細胞凋亡相關基因表達

利用RNA simple Total RNA Kit試劑盒提取SGC-7901細胞RNA，利用微量分光光度計測定RNA濃度，經瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA18S和26S條帶完整性。使用cDNA反轉錄試劑盒將RNA反轉為cDNA。以該cDNA為模板，用RT-qPCR法測定p53、Bax、Bcl-2基因以及與細胞周期相關基因表達量，以GAPDH為內參。引物序列如表1。

表1 用于 RT-qPCR 分析的引物序列Table 1 Oligonucleotide sequences for primers used in RT-qPCR

1.4 數據處理

所有數據均為3次以上試驗重復平均值，并做單因素或雙因素方差分析和Duncan氏顯著性測驗。當P<0.05時，認為差異顯著；當P< 0.01時，認為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 無花果葉片多糖對人體胃癌SGC-7901細胞增殖的抑制效應

2.1.1 不同品種不同月份多糖對SGC-7901增殖的抑制效應

3個無花果品種7～11月份的葉片多糖在2 mg/mL濃度下處理SGC-7901細胞48 h后，不同處理對細胞生長均表現出一定程度抑制效應(圖1)。從雙因素方差分析結果看，不同品種多糖對癌細胞增殖抑制有極顯著差異(F > F0.01)，其中‘布蘭瑞克’對癌細胞增殖抑制率最高，總平均值為29.12%，極顯著高于后兩者(P< 0.01)。‘波姬紅’和‘瑪斯義陶芬’的平均抑制率分別為21.89%和19.37%，沒有顯著差異(P> 0.05)。從月份上看，7月和9月對細胞抑制效果最佳，且兩者抑制率相似，而8月、10月和11月的抑制率極顯著低于7月和9月(P< 0.01)。從具體品種和具體月份上看，布蘭瑞克9月多糖的抑制率最高，在2 mg/mL濃度下達到46.67%，極顯著高于其他品種或月份(P< 0.01)。其次是7月份‘布蘭瑞克’和‘瑪斯義陶芬’葉片，其抑癌率分別為32.92%和31.62%。其他月份多糖樣品對細胞增殖的抑制率均小于30%，其中，‘瑪斯義陶芬’11月份葉片抑制率最低，僅有13.98%。這些結果為不同品種月份無花果葉片采集提供了理論依據。另外，介于‘布蘭瑞克’9月份葉片多糖抑癌率最高，可以選作后續試驗的試材。

圖1 不同品種和不同月份無花果葉片多糖(2 mg/mL) 對SGC-7901細胞增殖的抑制效應Fig.1 Inhibition of leaf polysaccharides in a dosage of 2 mg/mL of three Fig varieties harvested in different months on SGC-7901 cell proliferation注：圖中相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:The same letters in the Figure represent no significant difference at P = 0.05 level.

2.1.2 ‘布蘭瑞克’無花果9月份葉片多糖抑制SGC-7901細胞增殖的濃度效應

圖2顯示，0.5、1、2、4 mg/mL四個濃度‘布蘭瑞克’無花果葉片多糖對SGC-7901細胞增殖抑制率呈現出劑量效應。隨著多糖濃度增加，細胞增殖抑制率增加，相關系數r= 0.938*，達到P= 0.05顯著水平。當多糖濃度達到4 mg/mL時，細胞增殖抑制率為52.92%。

圖2 不同濃度無花果多糖對SGC-7901細胞增殖的抑制率Fig.2 Inhibition of Fig polysaccharide in different concentrations on the proliferation of SGC-7901 cell line注：圖中不同字母代表在P = 0.05水平上差異顯著。Note:The different letters above the bars in the Figure represent significant difference at P = 0.05 level.

2.2 無花果葉片多糖對癌細胞形態的影響

通過倒置顯微鏡可以觀察無花果葉片多糖處理后SGC-7901細胞形態。如圖3，經多糖溶液處理48 h后，對照細胞增殖旺盛，細胞密度高，而處理細胞密度隨著多糖濃度增加而迅速下降，說明細胞增殖受到顯著抑制。其次，經多糖溶液處理的細胞，死亡細胞數量增加，細胞形態從梭形逐漸變圓，細胞粘附性降低，表明無花果多糖導致胃癌SGC-7901細胞死亡。

圖3 不同濃度無花果多糖處理后SGC-7901細胞形態變化Fig.3 Morphological change of SGC-7901 cells treated by Fig polysaccharide in different concentrations注：A～E分別為0、0.5、1、2和4 mg/mL無花果多糖處理。Note:A-E are 0,0.5,1,2 and 4 mg/mL Fig polysaccharide treatment,respectively.

2.3 無花果葉片多糖阻滯SGC-7901細胞周期效應

癌細胞增殖是通過細胞分裂周期來實現的，細胞周期阻滯意味著細胞增殖受阻。圖4為流式細胞儀檢測出的SGC-7901細胞周期結果。從中可以看出，隨著無花果葉片多糖濃度增加，處于G1期的細胞比例逐漸減少，當多糖濃度達1 mg/L時，差異達到P= 0.05顯著水平。相反，處于S期細胞比例隨著多糖濃度上升而上升，當濃度為1 mg/L時，差異達到P= 0.05顯著水平。如果濃度為2 mg/L時，S期細胞比例比對照高出25.13%，暗示著大量細胞阻滯于S期。與此不同的是，G2期細胞比例在多糖濃度在0～2 mg/L之間，沒有顯著差異(P> 0.05)，只有多糖濃度達4 mg/L時，G2期細胞比例顯著高于低濃度多糖處理，暗示著高濃度多糖處理將導致部分細胞周期在G2期受阻。整體上看，無花果葉片多糖處理將SGC-7901細胞周期阻滯在S期，細胞增殖因此受到抑制。

圖4 不同濃度無花果多糖對SGC-7901細胞周期的影響Fig.4 Influence of Fig polysaccharide in different concentrations on the cycle of SGC-7901 cells注：A～E分別為0、0.5、1、2和4 mg/mL無花果多糖處理48 h后用流式細胞儀檢測出的細胞周期圖；F為不同濃度多糖處理后三個細胞周期階段的細胞所占的百分率，圖中相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:A-E are the cell cycles detected by flow cytometry after Fig polysaccharide treatments in 0,0.5,1,2 and 4 mg/mL,respectively,for 48 h,and F is the cell percentage at different stages of cell cycles.The same letters in the Figure represent no significant difference at P = 0.05 level.

2.4 無花果葉片多糖促進SGC-7901細胞凋亡

為了了解無花果多糖對SGC-7901細胞凋亡的影響，使用Annexin-V/PI試劑通過流式細胞儀對凋亡細胞進行定量分析。結果如圖5，其中象限Q1、Q2、Q3、Q4分別代表壞死、凋亡晚期、正常和凋亡早期細胞數量。在不同濃度多糖處理下，凋亡早期細胞百分率與對照相比沒有顯著差異，但是凋亡晚期細胞百分率隨著多糖濃度增加而上升。當多糖濃度為1 mg/mL時，處理比對照高出37.87%(P< 0.01)。當多糖濃度達到4 mg/mL，處理比對照高出150%。另一方面，無花果多糖處理的死亡細胞比例增加，而且這種效應在多糖濃度為0.5 mg/mL就存在(P< 0.05)，但是，在1、2、4 mg/mL間沒有差異。整體上看，活細胞百分率隨著多糖濃度上升而下降。當多糖濃度為1 mg/mL時，處理為對照的91.50%(P< 0.05)。多糖濃度達4 mg/mL時，處理降為對照的74.03%。這些結果表明，無花果多糖顯著促進SGC-7901細胞凋亡，降低活細胞比率。

2.5 無花果葉片多糖對SGC-7901細胞活性氧含量的影響

圖6結果顯示，不同濃度無花果葉片多糖處理促進SGC-7901細胞內ROS含量增加。當多糖濃度為0.5 mg/mL時，處理細胞平均熒光強度比對照高出2.32倍；當多糖濃度為4 mg/mL時，處理比對照高出5.58倍。顯然，無花果葉片多糖誘導SGC-7901細胞ROS含量急劇上升是其誘導細胞凋亡的重要原因。

2.6 無花果葉片多糖對SGC-7901細胞凋亡相關基因表達的影響

Bax是一種促細胞凋亡基因。圖7A結果顯示，無花果葉多糖處理顯著促進SGC-7901細胞Bax表達上調。這種效應在多糖濃度為0.5 mg/mL時就顯著存在(P< 0.05)。當濃度為2 mg/mL時，處理基因相對表達量比對照高出95%。類似地，p53為人體抑癌基因。該基因表達可以抑制癌細胞生長。圖7A顯示，除了無花果葉片多糖濃度為0.5 mg/mL時，p53的相對表達顯著降低對照外，其他濃度多糖處理的p53相對表達量均顯著高于對照(P< 0.05)，說明一定濃度無花果多糖處理可以上調p53表達。相反，Bcl-2為抑制細胞凋亡基因。隨著無花果多糖濃度上升，SGC-7901細胞內Bcl-2表達量逐漸下降。當多糖濃度為1 mg/mL時，處理效應達到P= 0.05顯著水平。當多糖濃度達4 mg/mL時，處理Bcl-2相對表達量只有對照的1/4，說明無花果多糖處理抑制了促癌基因表達。

圖7 不同濃度無花果多糖處理對SGC-7901細胞基因表達的影響Fig.7 Effect of Fig polysaccharide in different concentrations on the gene expressions of SGC-7901 cells注：A：細胞凋亡相關基因；B：細胞周期相關基因。同一基因相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:A:Apoptosis-related genes;B:Cell cycle-related genes.The same letters in each gene represent no significant difference at P = 0.05 level.

為闡明無花果多糖抑制SGC-7901細胞增殖效應與細胞周期相關基因表達的關系，本試驗檢測了細胞周期蛋白(Cyclins)以及細胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependent kinase，CDKs)編碼基因的相對表達量，結果如圖7B。隨著無花果葉片多糖濃度上升，兩類基因表達量均呈下降趨勢。其中，Cyclin B在mRNA水平下表達量受多糖濃度調節的效應最為明顯。當多糖濃度為0.5 mg/mL時，處理組表達量降為對照的66.21%；當多糖濃度為4 mg/mL時，只有對照的18.71%。Cyclin D1基因表達對多糖濃度也比較敏感，但是只有多糖濃度達2 mg/mL時，處理效應才達到P= 0.05顯著水平。此時，處理的相對表達量只有對照的44.00%。類似地，Cyclin E基因對無花果多糖處理也相當敏感，而且在0.5 mg/mL多糖處理時，相對表達量降至對照的62.81%(P< 0.05)。此后，隨著多糖濃度增加，下降幅度更大。當多糖濃度為4 mg/mL時，處理組僅為對照的31.86%，但由于標準誤較大，它與0.5 mg/mL處理間沒有顯著差異。另一方面，無花果葉片多糖抑制SGC-7901細胞周期蛋白依賴激酶基因CDKs表達。從圖7B可以看出，無論是CDK1，還是CDK2或者CDK6，經多糖處理后，基因表達量均明顯下降。就CDK1而言，0.5 mg/mL多糖處理的抑制效應沒有達到P= 0.05顯著水平，但當多糖濃度達到1 mg/mL后，處理組基因表達量只有對照的70.86%(P< 0.05)。對CDK2來說，基因表達水平隨著多糖濃度上升而下降。0.5 mg/mL多糖處理的效應就達到P= 0.05顯著水平。當多糖濃度達到2或4 mg/mL時，基因表達水平約為對照的60%。類似地，基因CDK6表達對無花果葉片多糖處理也非常敏感。當多糖濃度為0.5 mg/mL時，CDK6的相對表達量為對照的46.37%(P<0.05)。當多糖濃度升到4 mg/mL時，相對表達量僅為對照的21.42%。這些結果說明，無花果葉多糖顯著降低細胞周期相關基因表達。這對細胞周期、細胞增殖和細胞凋亡來說是至關重要的。

3 討論

業已證明，無花果多糖具有體外抗氧化活性[10]，能夠降血糖[8]，增強免疫力[7]，并具有抗腫瘤[11]等醫藥功效。Jiang[11]提出，無花果多糖對宮頸癌Hela和肝癌HepG2細胞都有明顯抑制活性，但對肺癌A549細胞的抑制活性較弱，說明無花果多糖對不同腫瘤細胞抑制效應不同。Guo等[10]證明，無花果多糖不同組分對人體肝癌HepG2、胃癌SGC-7901、結腸癌SW1116細胞均有明顯的抑制作用。其中2 mg/mL多糖組分-3對胃癌7901細胞的抑制率為54.49%。本文結果與此類似。當‘布蘭瑞克’品種葉片多糖濃度為2 mg/mL時對SGC-7901細胞增殖抑制率為46.67%(見圖1)；濃度為4 mg/mL時，抑制率達52.92%(見圖2)。再次證明，無花果多糖具有明顯的抑癌活性，適當濃度的多糖處理可以顯著抑制癌細胞增殖，導致細胞死亡(見圖3)。

前人有關無花果多糖及其抑癌活性研究很少涉及品種和采樣時間。但是，植物內含物活性會因品種和時間的不同而不同。Zhang等[14]發現，4個品種無花果葉片提取物均有降血糖作用，但不同品種對肝糖原的影響存在差異。本試驗也獲得類似結果。我們發現，不同無花果品種、不同采集時間的葉片多糖對SGC-7901細胞抑制活性存在明顯差異(見圖1)。在2 mg/mL試驗體系中，‘布蘭瑞克’的平均抑制率最高，‘波姬紅’次之，‘瑪斯義陶芬’最后，說明‘布蘭瑞克’品種葉片更適合于多糖開發。另外，該品種9月份葉片多糖抑癌活性最高，7～8月其次，10～11月最次。這些結果為無花果葉片多糖抑癌功效的開發利用以及原料選擇提供了一定理論依據。

前人關于無花果多糖抗腫瘤的機理研究側重于抗氧化活性[10]或者免疫功能提高[7,11]。然而本文觀察到，無花果多糖處理將引起SGC-7901細胞內ROS含量上升。這一效應在0.5 mg/mL無花果多糖處理后便顯著存在，并且隨著多糖濃度上升而上升。當多糖濃度為4 mg/mL時，處理細胞ROS含量比對照高出5.5倍(見圖6)，說明無花果多糖抑癌活性可能是通過誘導癌細胞ROS上升來促進癌細胞凋亡的。這一觀點也符合目前流行的看法。比如，Halliwell[15]提出，過量ROS會導致細胞膜、脂質、DNA的氧化損傷。Brosche等[16]認為，氧化應激與細胞凋亡有著密切相關性。Ding等[17]利用外源H2O2證明，活性氧能誘導細胞凋亡。最近有人證明，黃芪多糖誘導人胃癌MGC-803凋亡過程中能誘導細胞ROS增加[18]。據此看來，本文觀察到的無花果多糖誘導ROS上升是其抑癌的重要方面。

本試驗首次觀察到無花果多糖誘導SGC-7901胃癌細胞凋亡(見圖3)。經處理細胞其活細胞數量隨著多糖濃度上升而下降，凋亡晚期和死細胞數量顯著增加(見圖5)。進一步觀察表明，無花果葉片多糖抑癌效應可能與其抑制細胞周期有關。從圖4可以看出，無花果多糖對SGC-7901細胞周期的抑制效應主要體現在S期。隨著多糖濃度上升，停滯在S期的細胞數量顯著上升。曾報道，柑桔皮多糖對移植性腹水瘤H22細胞增殖的抑制作用也表現在細胞周期的S期[19]，枸杞多糖抑制宮頸癌Hela細胞周期則在S期和G2/M期[20]。以上結果說明，細胞周期受阻，特別是S期DNA合成受阻可能是無花果多糖抑制癌細胞增殖的重要機制。

業已明確，細胞周期蛋白(Cyclins)以及細胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)在細胞周期中起到核心調控作用[21]。不同生物體內存在著幾十種Cyclins，能與不同種類CDKs構成Cyclin-CDK復合體，在細胞周期的不同階段起到激酶作用，誘發蛋白磷酸化，調控細胞周期進程[22]。CDK2/Cyclin E復合體在G1晚期和S期高度表達。如果CDK2表達減弱，則S期啟動受阻[23]。Cyclin D1/CDK4/CDK6蛋白復合物處在CDK2/Cyclin E復合物上游，也對G1/S期細胞分裂起調控作用[24]。Zhong等[25]發現，桑黃多糖抑制人體結腸癌HT-29細胞增殖時，大量細胞停滯在S期，同時，CDK2和Cyclin E蛋白表達水平下降。Ma等[13]研究表明，山楂多糖抑制人體結腸癌HCT116細胞增殖時也能誘導CDK1、CDK2、Cyclin A1、Cyclin D1和Cyclin E1基因表達下調。本試驗結果與此類似。我們觀察到無花果多糖抑制人體胃癌SGC-7901細胞周期停滯于S期，同時細胞周期蛋白基因表達顯著下調(見圖7B)。經無花果多糖處理的SGC-7901細胞CDK1、CDK2、CDK6、Cyclin B、Cyclin D1和Cyclin E基因表達顯著下降(見圖7B)。也許，正是細胞周期蛋白編碼基因表達受抑，無花果多糖阻滯細胞周期，從而抑制癌細胞增殖。

除了上述Cyclins和CDKs外，無花果葉片多糖處理還影響到抑癌基因p53和Bax以及促癌基因Bcl-2的表達(見圖7A)。在這三個基因中，Bax與Bcl-2屬于同一基因家族，其中，Bcl-2促進細胞周期，而Bax與Bcl-2形成二聚體，當Bax高表達時,Bax會自身形成同源二聚體促進細胞凋亡[26]。曾報道，白花蛇舌草多糖處理HepG2細胞導致Bcl-2基因表達量下降[27]；生姜多糖處理HepG2細胞導致Bax和p53等基因表達上調，同時下調Bcl-2基因表達，誘導細胞凋亡[28]。我們把無花果多糖濃度、SGC-7901細胞增殖抑制率與Bax、Bcl-2以及p53相對表達量做兩兩相關分析后發現，無花果多糖濃度與增殖抑制率的相關系數r= 0.938*，細胞增殖抑制率與Bcl-2相對表達量的相關系數r= -0.932*，但其它幾項指標之間的相關性沒有達P= 0.05顯著水平。這暗示，雖然無花果多糖能夠誘導抑癌基因Bax和p53表達上調，但從濃度效應上看，促癌基因Bcl-2表達下調可能更為重要。

綜上所述，本文分析了不同品種不同月份無花果葉多糖對人體胃癌SGC-7901細胞增殖的抑制效應，發現‘布蘭瑞克’無花果品種9月份葉片多糖的抑制率最高。隨著多糖濃度上升，癌細胞增殖受抑，密度和粘附性下降，細胞形態從梭形變為圓形，活細胞減少，死亡細胞和凋亡晚期細胞比例上升。抑癌機理研究表明，無花果葉多糖將細胞周期阻滯在S期以及少量的G2期，促癌基因Bcl-2以及細胞周期相關基因(Cyclins和CDKs)表達下調，抑癌基因(Bax和p53)表達上調，細胞內活性氧積累增加。這些都是無花果多糖促進癌細胞凋亡的重要原因。這些結果為無花果葉片采集與抗癌藥物開發提供了一定理論依據。另外，目前已經開發出的無花果茶[12]，主要是以葉片為原料，在熱水沖泡過程中應該可以把無花果多糖浸提出來，但是它們是否具有抑癌活性，還有待進一步研究。