參苓白術散治療結直腸癌的網絡藥理學機制及分子靶點探討

田婷婷，劉 璇，葉 濤，楊 柱,3，龍奉璽,3，吳文宇，唐東昕,3*

1貴州中醫藥大學；2貴州中醫藥大學第一附屬醫院;3貴州省中醫腫瘤傳承與科技創新人才基地，貴陽 550002

結直腸癌(CRC)作為目前全球最常見的第三大惡性腫瘤，其發病率和死亡率持續增加，五年生存率一直不理想[1]。從表觀遺傳學改變來看，CRC的發生發展需要經歷10～15年的時間，但飲食偏嗜、紅肉過多攝入、年齡增加、炎性腸病、腸道微生態失衡等危險因素可快速的促進其發展[2,3]。目前手術、放化療、靶向治療為CRC的主要治療方法，但此類治療手段存在的毒副作用不容忽視，并對患者的生活質量帶來了極大的影響，嚴重制約了其療效。

中藥(traditional Chinese medicine，TCM)作為治療腫瘤疾病的替代藥，在治療CRC中優勢明顯，并與放化療聯合使用可顯著提高患者1～3年的生存率。參苓白術散(SLBZP)一方出自《太平惠民和劑局方》，主要由人參(Ginseng Radix et Rhizoma)、茯苓(Poria)、白術(Rhizoma Atractylodis Macrocephalae)、白扁豆(Lablab Semen Album)、蓮子(Nelumbinis Semen)、山藥(Dioscoreae Rhizoma)、砂仁(Amomi Fructus)、薏苡仁(Coicis Semen)、桔梗(Platycodonis Radix)、甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)十味藥物組成。SLBZP一方包含大量皂苷、黃酮、甾體、多糖、三萜類等化合物。臨床上，SLBZP聯合放化療使用，可有效改善CRC患者生活質量，提高患者免疫力，減輕放化療的毒副作用。Wang等[7]通過臨床隨機對照研究分析SLBZP聯合化療對CRC患者術后免疫功能及生活質量的影響發現，經過了12周的治療后，較化療組相比中藥聯合化療顯著抑制CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的表達、增加CD8+表達、提高KPS評分、增加對疾病的控制率(88.10%)、改善化療后毒副反應、提高患者生活質量。Zhang等[4]運用SLBZP聯合mFOLFOX6方案對CRC術后患者進行治療，顯著增強了機體免疫力，改善了化療后的毒副作用。人參、茯苓作為SLBZP中的君藥，主補人體五臟、調理脾胃氣機。現代研究表明，人參主要成分人參皂甙Rb2不僅能作用于TGF-β1/ Smad信號通路抑制人CRC細胞的生長、粘附、EMT及轉移[5]，還可激活P53途徑，增加促凋亡因子Bax的水平，促進HCT-116、SW620細胞的凋亡[6]；茯苓多糖(PCP)作為茯苓活性成分含量最豐富的一種(約占總成分的84%)，具有廣泛的抗腫瘤、免疫調節、抗炎等生物學活性。動物實驗也證明[7]，SLBZP可有效減少MDSC的浸潤，改善免疫抑制的腫瘤微環境；并通過下調TGF-β1、N-cadherin的水平，上調E-cadherin減輕EMT及β-catenin活化，減輕癌變過程。

中醫藥是我國的國粹，并經歷代醫療實踐者不斷檢驗、發展和完善。中藥講究君臣佐使，臨床組方常由多味藥物配伍而成。這些復雜的藥物多具有多活性成分、多作用靶點、多通路調控的特點，可作為治療復雜疾病的理想選擇，但如何較為清晰、客觀的挖掘分析各藥物活性成分的分子機制及相互作用，成了目前限制我國醫藥發展的巨大問題。因此，為了解決祖國醫學的發展中面臨問題，通過網絡藥理學分析中藥藥效的方法便應運而生。它作為一種系統網絡分析與藥理學結合的新方法，可用于通過化合物-靶標-疾病網絡闡明藥物活性成分的協同作用，預測在分子水平上通過多靶點多通路治療疾病的潛在機制，了解基因、蛋白、疾病之間的相互作用關系，為復雜中藥方劑的藥理研究提供了新的可能。

在本次研究中，使用網絡藥理學方法分析SLBZP的活性成分治療CRC的分子靶點和機制。并通過GEO數據庫獲取、篩選CRC患者和健康個體之間的差異表達基因來獲得CRC相關靶標，通過GO、KEGG分析得到SLBZP治療CRC的潛在作用機制。

1 資料及方法

1.1 SLBZP有效成分篩選

借助中藥系統藥理數據庫和分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，并根據口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-like，DL)≥0.18進行篩選[8]。得到SLBZP藥物活性成分190種，其中人參22種、茯苓15種、白術7種、白扁豆1種、蓮子11種、山藥16種、砂仁10種、薏苡仁9種、桔梗7種、甘草92種。

1.2 確定SLBZP潛在靶點

將190種候選化合物導入到DrugBank數據庫中(https://www.drugbank.ca/)獲取與SLBZP相應的靶標。除去44個與任何靶標無關的化合物后，最終選擇了146個化合物。并收集了146種化合物的相關靶點，確定了762個靶點，其中人參99種、茯苓18種、白術17種、白扁豆21種、蓮子188種、山藥66種、砂仁43種、薏苡仁27種、桔梗70種、甘草213種。除去重復后，總共收集了255個靶標。

1.3 CRC相關靶點確定

從GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得CRC患者的差異表達基因，系列：GSE25070，樣品：GSM615865、GSM615866、GSM615867、GSM615868、GSM615869、GSM615870、GSM615871、GSM615872、GSM615873、GSM615874、GSM615875、GSM615876、GSM615877、GSM615878、GSM615879、GSM615880、GSM615881、GSM615882、GSM615883、GSM615884、GSM615885、GSM615886、GSM615887、GSM615888、GSM615889、GSM615890、GSM615891、GSM615892、GSM615893、GSM615894、GSM615895、GSM615896、GSM615897、GSM615898、GSM615899、GSM615900、GSM615901、GSM615902、GSM615903、GSM615904、GSM615905、GSM615906、GSM615907、GSM615908、GSM615909、GSM615910、GSM615911、GSM615912、GSM615913、GSM615914、GSM615915、GSM615916。P<0.05 和| log 1(倍數變化)|的基因> 1個被認為具有明顯的差異表達和CRC相關靶標。

1.4 網絡構建

使用Cytoscape 3.5.1 軟件可視化SLBZP成分靶點-CRC靶點群網絡。從蛋白互作數據庫(DIP,Database of Interacting Protein)，生物通用交互數據集庫(BioGRID，database of protein and genetic interaction)，人蛋白參考數據庫(HPRD，human protein reference database)，IntAct 分子相互作用數據庫(IntAct，IntAct molecular interaction database)，分子相互作用數據庫(MINT，molecular interaction database)，生物分子相互作用網絡數據庫(BIND)中獲取蛋白相互作用關系，并借助Cytoscape 3.5.1插件 Bisogenet構建SLBZP與CRC蛋白質相互作用PPI網絡。

1.5 網絡合并

利用Cytoscape軟件合并SLBZP的預測靶點及CRC相關靶點。通過Cytoscape插件CytoNCA計算節點度值(degree centrality，DC)及中間性(betweenness centrality，BC)，篩選出交互的拓撲網絡中重要的靶點。

1.6 生物信息學分析

通過DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov，v6.8)進一步分析SLBZP-CRC靶點的生物學過程及作用機制。根據矯正后P<0.05篩選，選擇了前20個GO功能類別及顯著富集的KEGG信號通路。并構建了基因途徑網絡以篩選SLBZP治療CRC的關鍵靶基因。

2 結果

2.1 化合物-靶點篩選

190種SLBZP化合物(見表1)被選作最終候選活性成分。從GEO數據庫中確定了611個與CRC相關的目標。如圖1所示，并通過火山圖及熱圖形式顯示差異基因的分布情況，其中紅色表示上調基因，綠色表示下調基因。

表1 SLBZP有效成分Table 1 Active ingredients of SLBZP

續表1(Continued Tab.1)

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續表1(Continued Tab.1)

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圖1 差異基因表達熱圖(左)、火山圖(右)Fig.1 Differential gene expression heat map (left) and volcano map (right)注：在熱圖中，橫坐標表示分組，縱坐標表示差異基因，其中對照組在前，模型組在后；火山圖中，橫坐標代表基因表達的倍數變化，縱坐標代表基因表達變化的統計顯著性。紅色代表上調基因，綠色代表下調基因。Note:In the heat map,the abscissa represents the grouping,and the ordinate represents the differential gene,where the control group is in the front and the model group is the back;in the volcano chart,the abscissa represents the fold change of gene expression,and the ordinate represents the statistically significant change in gene expression Sex.Red represents up-regulated genes,and green represents down-regulated genes.

2.2 化合物-靶點網絡分析

將篩選出的化合物與差異基因互相映射，在SLBZP所有活性成分中，有28個化合物可調控與CRC相關靶點。故構建SLBZP化合物-CRC差異基因靶點網絡，如圖2所示，該網絡包含59個點(SLBZP中的28個化合物和31個差異基因)和70條邊，表明SLBZP可通過多成分、多靶點治療CRC。其中槲皮素(21個靶點)、山奈酚(5個靶點)、β-胡蘿卜素(5個靶點)、豆甾醇(4個靶點)、異黃酮(4個靶點)、薯蕷皂苷元(3個靶點)作用于多個靶點，因為它們在網絡中占有重要位置，可能是SLBZP的關鍵活性化合物。

圖2 SLBZP-CRC差異基因網絡圖Fig.2 SLBZP-CRC differential gene network diagram注：外圈紫色代表差異基因，淺綠色：山藥；深綠色：甘草；紅色：多味草藥共同成分；黃色：茯苓；玫紅色：蓮子；深藍色：桔梗；淺紅色：砂仁；淡藍色：薏苡仁；金黃色：人參；淡紅色：白扁豆。Note:The outer ring purple represents the differential gene;Light green:Dioscoreae Rhizoma;Dark green:Glycyrrhizae Radix et Rhizoma;Red:Common ingredients of various herbs;Yellow:Poria;Rose red:Nelumbinis Semen;Dark blue:Platycodonis Radix;Light red:Amomi Fructus;Light blue:Coicis Semen;Golden yellow:Ginseng Radix et Rhizoma;Light red:Lablab Semen Album.

2.3 PPI 網絡分析

蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)調控著大規模的生物過程，PPI所獲得的網絡在大多數生物學功能和過程中非常重要，且大多數蛋白質的功能需要通過相互作用來激活[9]。因此，如圖3所示，使用PPI數據可視化SLBZP預測目標和CRC相關目標的PPI網絡。PPI網絡中，包含1 130個節點及565個邊，其中，每個節點代表著不同的蛋白，565條邊代表565種相互作用關系。

圖3 SLBZP-CRC差異基因網絡圖Fig.3 SLBZP-CRC differential gene network diagram注：確定SLBZP調控CRC的候選目標，A.SLBZP預測靶點與CRC相關靶點蛋白相互作用網絡；B.根據DC大于61，從圖A中提取的重要蛋白質的PPI網絡；C.根據BC大于100，從圖B中提取的SLBZP用于治療CRC的候選靶點PPI網絡。Note:To determine the candidate targets of SLBZP regulating CRC,A.SLBZP predicts the interaction network between target and CRC-related target protein;B.According to DC greater than 61,the PPI network of important proteins extracted fromFig.A;C.According to the BC is greater than 100,the SLBZP extracted from Figure B is used to treat the CRC candidate target PPI network.

2.4 確定SLBZP調控CRC的候選靶點

為了深入分析SLBZP調控CRC的作用機制，將SLBZP-CRC相關靶基因合并構建PPI網絡。該網絡由1 130個節點和17 529個邊組成，根據Li[10]、Zhang等[11]研究，認為在所有蛋白的degree中，超過中位數兩倍的為樞紐蛋白，故本研究通過各個蛋白degree，取大于DC、BC中位數兩倍的值作為核心蛋白的篩選標準，故DC>61，BC>100。如圖3B所示。根據DC大于61，構建了針對SLBZP調控CRC的重要目標網絡，其中包含166個節點和8 524個邊。根據BC大于100，進一步篩選候選目標，得到69個目標靶點，確定為SLBZP最終調控CRC的69個靶基因，如圖3C所示。

2.5 GO、KEGG富集分析

通過DAVID數據庫對31個差異基因進行GO和KEGG信號通路富集分析，基于分子生物學功能(molecular function，MF)、生物學過程(biological process，BP)、細胞學組分(cellular components，CC)分析了候選靶點的生物學過程。如圖4A所示，根據FDR<0.05，篩選前面富集最顯著的生物學過程，其中BP有2個，CC有2個，MF有1個，其中紅色代表上調，藍色代表下調。如圖4B所示，5種不同顏色代表不同的生物學過程，在這些生物學過程中，與之相關的基因有18個，紅色代表上調基因，藍色代表下調基因，其中顏色越深代表調節越顯著。

圖4 SLBZP治療CRC的候選目標的GO分析Fig.4 GO analysis of the candidate targets of SLBZP for the treatment of CRC注：根據FDR <0.05富集前面最顯著的5個GO功能類別。圖A中外圈弧形代表各個生物學功能，弧形中的各圓點代表基因，其中紅色代表上調，藍色代表下調；內圈中的弧形代表基因富集的顯著性，弧形越高，富集越顯著;Z-Score越高，上調基因越多。圖B中，右邊部分根據顏色不同代表不同的生物學過程，左邊部分根據顏色不同代表各個基因所參與的生物學過程，紅色代表上調基因，藍色代表下調基因。Note:According to FDR <0.05,the top 5 most significant GO functional categories are enriched.In Figure A,the outer circle arc represents each biological function,and the dots in the arc represent genes,where red represents up-regulation and blue represents down-regulation;the arc in the inner circle represents the significance of gene enrichment,the higher the arc,the more significant the enrichment;the higher the Z-Score,the more up-regulated genes.In Figure B,the right part represents different biological processes according to different colors,and the left part represents the biological processes involved in each gene according to different colors.Red represents up-regulated genes,and blue represents down-regulated genes.

通過KEGG途徑分析得出了在治療CRC過程中受SLBZP顯著影響的信號途徑如圖5所示。根據P<0.05確定了20個顯著富集的途徑，包括化學致癌、藥物代謝-細胞色素P450、IL-17、沙門氏菌感染、腫瘤壞死因子等。

圖5 SLBZP治療CRC的KEGG信號通路Fig.5 KEGG signal pathway of SLBZP in the treatment of CRC注：根據P<0.05富集前面最顯著的20條通路，橫坐標代表基因數目，縱坐標代表信號途徑，顏色代表P值。Note:According to P<0.05,the 20 most significant pathways in the front are enriched.The abscissa represents the number of genes,the ordinate represents the signal pathway,and the color represents the P value.

2.6 基因途徑網絡分析

基于顯著富集的信號通路和調控這些通路的基因構建了基因-通路網絡，如圖6所示。利用Cytoscape 3.5.1軟件，通過中間性(BC)對這20條通路和23個基因進行拓撲分析。圖中正方形代表靶基因，V形代表網絡中的信號通路。網絡圖表明，FOS、IL-1B具有最大的 BC，為核心基因，MMP9、VEGFA、ADH1C、STAT1、ADH1A、CCND1、CXCL2、CLAL1、IL-1A等是SLBZP途徑網絡中治療CRC的關鍵基因。它們可能是SLBZP治療CRC的關鍵靶點。

圖6 SLBZP調控CRC的靶點-途徑網絡Fig.6 Target-pathway network of SLBZP in the regulation of CRC注：對20條通路和23個基因進行拓撲分析，并以BC為中心。圖中綠色方塊代表靶基因，紅色V形代表信號通路。圖形尺寸大小代表中間性的大小。Note:Topological analysis was performed on 20 pathways and 23 genes,with BC as the center.The green square in the Figure represents the target gene,and the red V-shape represents the signal pathway.The size of the Figure represents the size of the intermediateness.

3 討論

中醫獨特的理念經歷了數千年的發展和傳承，常用于各種疾病的預防和治療。中藥復方通常為多種草藥根據君、臣、佐、使配伍運用，達到協同增效、藥到病所、扶正祛邪的目的。CRC屬于中醫“臟毒”“腸風”“腸蕈”“鎖肛痔”“癥瘕”“積聚”等范疇，多因正虛邪實，寒、痰、濕、毒、瘀等凝結成癰，下聚于大腸而發病。治療常以扶正祛邪、健脾益氣、清熱利濕為主，實現毒瘀積聚消散，機體正氣充沛，改善疾病癥狀，提高生活質量的目的。SLBZP作為健脾滲濕、扶正固本的經典方劑，臨床常用于潰瘍性結腸炎(UC)的治療，并可聯合放化療顯著增強CRC患者的免疫功能，減輕腸道炎性反應，優化腸道菌群結構等。中醫治病講究整體觀念，著眼于機體整體功能的恢復和病因的消除。網絡藥理學的概念一經提出，便快速的與中藥復方相結合進行研究，可較為全面的闡明中醫藥治療疾病的整體觀念，分析中藥復方復雜的作用機制。因此，在多種數據庫平臺的支持下，利用生物信息學手段分析中藥復方復雜的藥用成分及作用機制，使藥物的具體功效顯得清晰明了。

在本研究中，根據OB、DL篩選出了SLBZP的190種化合物及255個靶基因，并通過與CRC患者和健康個體之間的611個差異表達基因進行合并取交集。根據FDR<0.05、logFC>1，最終確定SLBZP與CRC相關基因31個。構建了SLBZP化合物-CRC靶點網絡。結果表明，SLBZP的大多數化合物可調控多個靶點，如槲皮素、山奈酚、豆甾醇分別作用于21個、5個、4個靶點，它們在網絡中占有重要位置，所以，很可能是SLBZP的關鍵活性化合物。雖然各個單味藥的預測靶點數量不同，但作用靶點有諸多重復。不難得出SLBZP的多種活性成分具有協同增效調控靶點的作用。槲皮素作為目前研究最為分布廣泛的類黃酮之一，其強大的抗氧化應激及抗炎活性已得到充分證明，并被認為在治療和預防糖尿病、癌癥、神經退行性疾病和心血管疾病等方面發揮重要作用。就對腫瘤的作用而言，槲皮素可調節多種生物途徑，誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管新生、防止腫瘤細胞的增殖。研究表明[12]，槲皮素作為β-catenin有效的抑制劑，可在CRC SW480細胞中誘導Wnt/β-catenin的下調，防止CRC的發展進程。Hu等[13]通過制備槲皮素納米顆粒制劑(35 nm)研究其對膀胱癌腫瘤微環境的影響發現，槲皮素顆粒制劑能增加藥物對腫瘤屏障的滲透性，顯著降低腫瘤中的活性成纖維細胞生長及膠原量，使腫瘤組織中的膠原蛋白含量正常化達到抗腫瘤的目的。山萘酚是存在于不同植物物種中的天然黃酮醇，大量的體外實驗證明了山奈酚具有顯著的抗炎作用，并可通過阻滯腫瘤細胞周期、防止腫瘤血管新生、促進腫瘤細胞凋亡、防止腫瘤細胞遷移等方式抑制腫瘤的發展[14]。但是，因藥物在體內的利用度通常受到轉運蛋白通透性、親脂性、腸系膜結構、腸上皮細胞輸送等因素的影響，使山奈酚具有較低的口服利用度，故限制了其作為抗癌劑的使用，但是據報道發現山萘酚與槲皮素聯合使用可通過阻斷槲皮素的外排，顯著增強槲皮素的抗癌作用，與順鉑聯合使用可顯著增加其對細胞的毒性作用[15]。豆甾醇作為抗癌候選藥，也顯示出顯著的抗癌作用。其可通過破壞TNF-α-VEGFR-2軸抑制腫瘤內皮細胞的增殖、遷移和毛細血管網絡的形成，有效的下調炎性細胞因子的產生，巨噬細胞募集和腫瘤血管生成，實現抑制腫瘤生長的目的[16]。中藥成分復雜，盡管網絡藥理學能較全面的分析中藥的化學成分及作用機制，但各方中的總有效成分及相互作用后的協同效應仍不能解決。而藥物治療疾病均是多成分共同作用的結果。在本次研究中，槲皮素、山奈酚、豆甾醇調節了CRC的大部分相關靶點，且均具有抗炎、抗腫瘤的特性，因此可將他們視為SLBZP的具有代表性的化合物。

將SLBZP預測靶點和CRC相關靶點進行合并，通過PPI網絡進行結構化，為了更準確的分析SLBZP與CRC共同靶點與相關蛋白的相互作用關系，設置了包括DC、BC在內的2個參數來篩選節點并構建新的網絡。通過PPI網絡分析發現，SLBZP治療CRC相關靶點與其他蛋白交互作用強，其對CRC的治療可能與其他蛋白的相互作用協同發揮調控作用。

通過GO富集分析SLBZP針對CRC靶點在BP、CC、MF中的富集情況。結果表明SLBZP調節了某些生物學過程，例如細胞外基質分解、膠原分解代謝過程、酒精脫氫酶活性等有關。上皮到間質轉化(EMT)在胚胎發生和癌變中均起關鍵作用。就腫瘤而言，EMT與癌細胞的侵襲、轉移、耐藥性、預后差等有關。EMT通常是由TGF-β等細胞因子誘導的，通常TGF-β通過激活幾種信號傳導途徑，下調E-cadherin的表達和磷酸化β-catenin蛋白，降低E-cadherin-β-catenin(Eβ)復合物的濃度，破壞細胞間的黏附[17]。細胞外基質(ECM)在癌癥發展過程中會經歷組成和結構的急劇變化，腫瘤細胞外基質富含膠原I和纖連蛋白等，并通過LOX介導的膠原交聯從隨機網絡重組為對齊的網絡，以此增加ECM的密度，促進腫瘤細胞的存活和繁殖，增加腫瘤細胞的運動性，促進腫瘤細胞的侵襲，還常常導致腫瘤對放射療法的抵抗，這種細胞外基質的重塑可直接影響癌癥的進程[16]。而膠原蛋白和纖連蛋白在內的纖維狀ECM蛋白的沉積和交聯增加，EMT導致的細胞間黏附減少，使細胞基質和細胞間粘附不平衡也是癌癥進展的基礎。全球范圍內約有3.6%的癌癥是由飲酒導致的，酒精可與包括CRC在內的消化道惡性腫瘤建立密切的聯系，因此國際癌癥研究機構(IARC)將酒歸為人類致癌物的第一類[18]。酒精致癌機理為：干擾DNA的合成和修復；促進細胞內基因突變；改變代謝途徑；大量消耗視黃酸使組織分化低、變性高，進入惡變前狀態等。在CRC患者中，血清中乙醇脫氫酶(ADH)的活性較健康粘膜顯著增高，醛脫氫酶(ALDH)活性卻顯著降低，兩者活性出現異常失衡的情況，導致大量毒性乙醛的產生[19]。而SLBZP可以通過干預這些生理、病理過程預防腫瘤的發生、發展。

中藥以多成分、多靶點、多途徑的優勢治療疾病。復方SLBZP也具有相同的特性，以多成分、多靶點、多途徑的方法治療CRC。在本研究中，包括化學致癌、沙門氏桿菌感染等信號通路在內的20條KEGG信號通路得到了顯著的富集。由于飲食習慣及職業危害等，化學致癌所導致的CRC發病一直在增加。在高溫(>130 ℃)烹飪或經空氣污染過的食物，通常會產生多環芳烴(PAH)、雜環胺(HCA)、N-亞硝基化合物(NOC)、霉菌毒素(黃曲霉毒素)和丙烯酰胺等致癌物，作為CRC潛在的危險因素急需被人們認識[20]。大多數流行病學研究觀察均得出HCA攝入與CRC呈正相關，其誘變CRC相關風險指數增加了30%。硝酸鹽作為添加在食物制品中的有效的防腐劑不僅可阻止肉毒桿菌的生長，還能增強加工肉的顏色和風味。但越來越多的證據表明其可導致內源性NOC形成，發揮強烈的致癌作用。NOC其主要致癌機制為增加腸道異常隱窩灶(ACF)及粘液耗竭灶(MDF)的產生，使腸道上皮細胞DNA突變，促進CRC大發生。隨著高通量測序的發展，腸道菌群與CRC的關系正在被揭示。大量研究認為，腸道菌群結構的紊亂，病原可通過引發腸道慢性炎癥反應改變細胞生物學，成為CRC發展的重要誘因。每年大約有9 000多萬人感染沙門氏菌，并有超過2 500種不同血清型的腸沙門氏菌亞種存在于腸道中[21]。沙門氏菌影響著與腫瘤相關的多種信號途徑，其通過在細胞中分泌的效應蛋白激活AKT和ERK途徑，而這些途徑在許多癌癥中通常也被激活。在Wnt信號通路中，沙門氏菌效應無毒蛋白A(AvrA)可通過T3SS轉移到宿主細胞中，在AvrA的去泛素化酶活性作用下防止β-catenin降解，促進β-catenin在細胞核內大量募集，通過與TCF/LEF相結合，下調原癌基因MYC、CCND1的表達，同時，AvrA可通過激活AKT，使絲氨酸上的β-catenin磷酸化以進一步促進核β-catenin信號傳導[22]。綜上所述，化學致癌、腸道炎癥、病原菌數量增加等因素，均是CRC發展的重要因素。SLBZP作為健脾益氣的經典方，可以促進有效增加機體抗炎因子表達，增強免疫反應，調節腸道菌群，保護腸上皮細胞免受損傷，防止CRC的發展。在本研究中，上述途徑作為顯著富集并與CRC密切相關的信號通路，表明與CRC發生有關的途徑的調控可能是SLBZP治療CRC的機制之一。此外，SLBZP可能通過調節其他途徑起作用，包括TNF途徑，Toll樣受體途徑、IL-17途徑等。

本研究還構建了基因通路網絡以研究SLBZP針對CRC的關鍵靶基因。結果表明FOS、IL-1B具有最大BC，它可能是核心靶點。其他前9個基因(MMP9、VEGFA、ADH1C、STAT1、ADH1A、CCND1、CXCL2、CLAL1、IL-1A)被選為關鍵靶基因。FOS作為CRC轉移的關鍵驅動因素，位于人類14q21-31染色體上，編碼核蛋白c-Fos。單獨的c-Fos蛋白沒有生理功能，必須與c-Jun結合形成具有轉錄激活活性的異二聚體(AP-1)，AP-1與細胞的增殖、分化密切相關，c-Fos和c-Jun的表達在正常組織中低，在許多惡性腫瘤和癌變過程中高。Chen等[23]為了明確在FOS影響下機體CRC的易感性，分析了c-Fos蛋白在16例CRC患者癌組織及癌旁正常組織中的表達發現，CRC組織中c-Fos蛋白的表達水平顯著增加，存活率顯著降低。炎癥作為癌變的各階段的影響因素，越來越引起重視。有不少研究表明，經常服用非甾體類抗炎藥可顯著降低患CRC的風險。這也間接證明了炎癥反應促進了CRC的發生。IL-1B(IL-1β)作為促炎的“警報”因子，在炎癥及癌癥早期便被激活，CRC患者中IL-1β表達水平出現顯著升高，并與疾病的嚴重程度、預后有關。與大部分其他腫瘤疾病，CRC是血管高度生成的腫瘤，血管的高效率生成是提高CRC細胞存活、增殖、轉移的重要因素。而IL-1β/IL-6途徑可通過刺激潛在促血管生成因子COX-2的表達，促進血管的新生，刺激腫瘤細胞的生長，且三者的表達有顯著的相關性，COX-2的過度表達受IL-1β、IL-6顯著升高調控[24,25]。

本研究使用網絡藥理學方法探討了SLBZP對CRC的作用機理和分子靶點。槲皮素(21個靶點)、山奈酚(5個靶點)、β-胡蘿卜素(5個靶點)、豆甾醇(4個靶點)、異黃酮(4個靶點)、薯蕷皂苷元(3個靶點)作用于多個靶點，因為它們在網絡中占有重要位置，可能是SLBZP的關鍵活性化合物。因此，SLBZP可能通過以上關鍵化合物起作用，進一步影響特定的生物學過程，調節腫瘤細胞的增殖、遷移，并在抑制炎性反應，防止化學致癌，優化腸道菌群結構等途徑中發揮治療作用。FOS、IL-1B、MMP9、VEGFA、ADH1C、STAT1、ADH1A、CCND1、CXCL2、CLAL1、IL-1A是SLBZP治療CRC的關鍵基因，也進一步驗證了中藥復方可多成分、多靶點、多途徑治療復雜疾病的優勢。