防風不同極性部位對腹瀉大鼠的止瀉作用和結腸不同亞型AQP的調控

梁瑞峰，葛文靜，李兵杰，宋獻美，張艷燕，王慧森，李更生*

1河南省中醫藥研究院中藥研究所，鄭州 450004；2河南中醫藥大學藥學院，鄭州 450046；3河南醫學高等專科學校檢驗系，鄭州 451191

腹瀉是一組由多病原、多因素而導致大便次數增多、性狀稀薄或呈水樣，常伴有腹痛、嘔吐、發熱等臨床癥狀及不同程度水液、電解質紊亂的消化系統疾病，流行病學研究顯示每年全球人群腹瀉發生率約為5%[1]，也是導致5歲以下兒童死亡的第2大原因[2]。腸道是水液轉運代謝的主要部位，每天大約有9 L的水在腸道分泌和吸收，對維持體內水液平衡和消化吸收功能具有重要意義，腸道對水的重吸收下降是產生腹瀉的重要原因。結腸對水的重吸收是逆梯度的主動吸收過程，主要依靠水通道蛋白(aquaporin，AQP)的轉運功能來完成。AQP是負責水分子跨膜轉運的主要蛋白，可高效、有選擇性地轉運水分子以維持細胞內外環境的水液平衡。腸道中表達至少11種不同亞型的AQP，其不僅是腸道水分子吸收代謝的重要載體，還參與了腸內黏液、營養液的分泌和腸道細胞內外環境的穩態維持，在一些腸神經功能調控中具有重要作用。AQP在腸道表達異常可造成腸道環境紊亂，導致水分子吸收減少，使水分子大量聚集在腸腔中，引起腹瀉的發生[3]。隨著對AQP的研究不斷深入，AQP有望成為許多與水液代謝轉運有關的腸道疾病的防治靶點[4]。

腹瀉屬中醫學“泄瀉”范疇，中醫認為“濕勝則濡瀉”“無濕不成瀉”，濕邪為本病病機的關鍵。風藥是具有祛風勝濕、升發清陽等作用的一類藥物，以其辛香溫燥之性治療泄瀉作用顯著[5]。防風是風藥的典型代表，為傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.的干燥根，具有祛風解表、勝濕止痛的功效，并且以其升清燥濕之性用于脾虛濕勝、清陽不升所致的泄瀉。防風治療腹瀉的臨床療效確切，但其對腹瀉大鼠腸道AQP的影響未見報道。本研究采用番瀉葉灌胃建立大鼠腹瀉模型，通過觀察防風及其不同極性提取部位對腹瀉大鼠體質量、腹瀉指數、電解質、二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、Na+-K+-ATPase、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和結腸組織中AQP-3、AQP-4、AQP-8和AQP-9蛋白表達的影響，探討防風止瀉的可能作用機制，有助于拓展風藥的臨床應用，也為開發相關藥物提供參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，體重180～200 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(豫)2015-0004，飼養于河南省中醫藥研究院實驗動物中心，標準飼料喂養，自由飲食飲水。本研究經河南省中醫藥研究院實驗動物倫理委員會批準(批準號HNZYYYJ2019-0034)，符合實驗動物倫理學要求。

1.2 藥品與試劑

防風、番瀉葉購自亳州市張仲景中藥飲片有限責任公司，經河南省中醫藥研究院中藥研究所王慧森副研究員鑒定，分別為傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.的干燥根和豆科植物狹葉番瀉CassiaangustifoliaVahl的干燥小葉；復方地芬諾酯片(安陽市華安藥業有限責任公司，批號：20190402)；鈉、鉀、氯、Na+-K+-ATPase測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20191107、20191213、20191204、20191219)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、二胺氧化酶(DAO)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20191023、20191101；水通道蛋白-3(AQP-3)、AQP-4、AQP-8、AQP-9、β-actin抗體和羊抗兔IgG二抗(北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為AH06123353、AI10268996、AH09112517、AE11369128、AD10061684、AC20012695)；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

Synergy NEO全功能酶標儀(美國Bio-Tek公司)；T18型勻漿機(德國IKA公司)；2K15高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；CX31顯微鏡(日本Olympus公司)；DYCZ-24DN垂直電泳儀、DYCZ-40D轉印電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；FluorChem R凝膠成像分析儀(美國ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

防風總提取物：防風粉碎過40目篩，稱取500 g藥材粉末，加入8倍量95%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并濾液，回收溶劑至無乙醇氣味，得乙醇提取物77.64 g。剩余殘渣用6倍量蒸餾水煎煮2次，每次1.0 h，過濾合并，濃縮干燥后得水提取物35.89 g。將乙醇提取物與水提取物混合，作為防風總提取物，取一部分用于制備防風不同極性部位，其余實驗時用2%吐溫-80配制成含生藥量2.5 g/mL的溶液。

防風不同極性部位的制備：稱取防風總提取物用適量蒸餾水制成混懸液，然后依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，分別合并各部分萃取液，減壓回收溶劑得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位。實驗時用2%吐溫-80配制成含生藥量2.5 g/mL的溶液。

番瀉葉溶液的制備：番瀉葉加蒸餾水浸泡30 min，煎煮10 min，減壓濃縮至生藥含量0.5 g/mL，4 ℃保存。

2.2 分組造模及給藥

80只SD大鼠，雌雄各半，適應性飼養5天后按體質量隨機分為正常組(normal，Nor)、模型組(model，Mod)、地芬諾酯組(diphenoxylate，Dip，3 mg/kg)、防風石油醚萃取部位組(petroleum ether fraction，PEF)、乙酸乙酯萃取部位組(ethyl acetate fraction，EAF)、正丁醇萃取部位組(n-butanol fraction，NBF)、水溶性部位組(aqueous fraction，AF)和總提取物組(total extract，TE，按人與大鼠等效劑量的5倍確定防風不同部位給藥劑量，均按生藥量為5.0 g/kg)，每組10只。除正常組外其余各組每天灌胃番瀉葉水煎液20 mL/kg[6]，連續7天，于造模第8天開始，各組大鼠上午灌胃番瀉葉水煎液，下午灌胃相應藥物，正常組與模型組給予等體積的2%吐溫-80溶液，連續給藥7天。

2.3 檢測指標

2.3.1 一般情況

造模前、給藥前、末次給藥后分別觀察大鼠精神狀態和活動情況、毛色，稱量體質量并記錄。

2.3.2 腹瀉指數

給藥前、末次給藥后大鼠單只單籠飼養，籠底鋪好濾紙，4 h后取出濾紙觀察糞便并計算腹瀉指數。腹瀉指數=稀便率(每只大鼠所排稀便數與總便數之比)×平均稀便級(每只大鼠所有稀便級數總和與稀便數之比)。稀便級根據濾紙上污跡范圍的大小分為4級：1級，污跡直徑<1 cm；2級，污跡直徑1～1.9 cm；3級，污跡直徑2～3 cm；4級，污跡直徑>3 cm。

2.3.3 大鼠血清中電解質含量

末次給藥后24 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，在3 000 rpm離心分離血清，比濁法檢測大鼠血清中鈉離子(Na+)含量，微板法檢測大鼠血清中鉀離子(K+)、氯離子(Cl-)含量。

2.3.4 大鼠DAO、TNF-α、Na+-K+-ATPase的變化

取血離心分離血清，微量法檢測大鼠血清中DAO活性，酶聯免疫吸附法測定TNF-α的含量。取血后快速分離大鼠結腸組織，分為兩部分，取一部分精確稱重后加生理鹽水冰浴條件下制成10%勻漿，在4 ℃、12 000 rpm離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書微量法檢測大鼠結腸中Na+-K+-ATPase活性。

2.3.5 結腸組織病理學變化

取一部分結腸用4%多聚甲醛溶液固定，常規脫水、包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察。

2.3.6 Western blot檢測結腸中不同亞型AQP的表達

稱取大鼠結腸組織，RIPA裂解液提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性后取等量蛋白經10% SDS-PAGE電泳分離，然后轉移至PVDF膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，棄封閉液，漂洗3次后分別加AQP-3(1∶800)、AQP-4(1∶600)、AQP-8(1∶600)、AQP-9(1∶600)及內參β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜，漂洗后滴加二抗室溫孵育1 h，ECL顯色液曝光，拍照，Image J軟件對蛋白條帶進行分析，以目的條帶/β-actin灰度值分析結腸中各亞型AQP的蛋白表達。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠一般情況

正常組大鼠活動自如，毛發光澤正常，飲食飲水及大小便如常，體質量增長規律。除正常組外其他組大鼠造模后精神萎靡，毛發干枯光澤明顯變差，活動減少，體質量明顯降低，造模后第5天各組大鼠腹瀉率已達100%，大便稀軟不成形，次數增加，肛周污濁。給藥后地芬諾酯組、防風石油醚組、正丁醇組和總提取物組大鼠精神狀態、體質量和腹瀉程度有不同程度改善，而防風乙酸乙酯組和水部位組大鼠體質量和精神狀態恢復不明顯(見表1)。

表1 不同時間各組大鼠體質量變化Table 1 Body weight of rats in each group at different = 10)

3.2 腹瀉指數

與正常組大鼠相比，給藥前各組大鼠腹瀉指數顯著增高(P< 0.01)，與模型組比較，給藥7天后地芬諾酯組、防風石油醚部位組、正丁醇部位組和總提取物組大鼠腹瀉指數明顯降低(P< 0.05或P< 0.01)，防風乙酸乙酯部位組和水部位組大鼠的腹瀉指數無統計學差異(見表2)。

表2 不同時間各組大鼠的腹瀉指數Table 2 Diarrhea index of rats in each group at different = 10)

3.3 防風不同極性部位對腹瀉大鼠血清電解質的影響

與正常組大鼠比較，模型組大鼠血清中Na+、K+和Cl-濃度顯著降低(P< 0.05或P< 0.01)。與模型組比較，地芬諾酯組大鼠血清中Na+、K+和Cl-濃度明顯升高(P< 0.05或P< 0.01)，防風正丁醇部位組和總提取物組大鼠血清中Na+和K+濃度明顯增加(P< 0.05或P< 0.01)，防風石油醚部位組大鼠血清中Na+濃度升高(P< 0.05)(見表3)。

表3 防風不同極性部位對腹瀉大鼠血清電解質的影響Table 3 Effects of different polarity extracts of S.divaricata on serum electrolytes in diarrhea = 10)

3.4 防風不同極性部位對腹瀉大鼠DAO、TNF-α和Na+-K+-ATPase的影響

與正常組大鼠比較，模型組大鼠血清中DAO和TNF-α水平顯著升高，結腸組織中Na+-K+-ATPase活性降低(P< 0.01)。與模型組比較，地芬諾酯組、防風正丁醇部位組和總提取物組大鼠血清中DAO和TNF-α水平明顯降低，結腸組織中Na+-K+-ATPase活性增加(P< 0.05或P< 0.01)，防風石油醚部位組大鼠血清中TNF-α含量明顯減少，結腸組織中Na+-K+-ATPase活性升高(P< 0.05)(見表4)。

表4 防風不同極性部位對大鼠DAO、TNF-α和Na+-K+-ATPase的影響Table 4 Effects of different polarity extracts of S.divaricata on the levels of DAO,TNF-α and Na+-K+-ATPase in diarrhea rats ± s,n = 10)

3.5 各組大鼠結腸組織病理學變化

正常組大鼠結腸黏膜上皮結構正常，細胞排列整齊，未見腸黏膜表皮細胞壞死脫落，固有層腺體無萎縮，黏膜下層未見明顯改變；模型組大鼠腸黏膜明顯萎縮，絨毛稀疏倒伏不規整，短縮融合，結腸隱窩、腺管部分區域黏膜上皮壞死脫落，可見炎性細胞浸潤；地芬諾酯組、防風石油醚部位組、正丁醇部位組和總提取物組大鼠結腸黏膜上皮及腺管排列相對整齊，少量炎性細胞浸潤，絨毛損傷有不同程度改善。防風乙酸乙酯部位組和水部位組較模型組病理變化沒有明顯改善(見圖1)。

圖1 各組大鼠結腸組織病理學形態(HE，×200)Fig.1 Pathomorphology of colonic tissue in rats of each group (HE,×200)注：A：正常組；B：模型組；C：地芬諾酯組；D：石油醚部位組；E：乙酸乙酯部位組；F：正丁醇部位組；G：水部位組；H：總提取物組；下同。Note: A:Nor;B:Mod;C:Dip;D:PEF;E:EAF;F:NBF;G:AF;F:TE;The same below.

3.6 防風不同極性部位對腹瀉大鼠結腸中不同亞型AQP表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠結腸組織中AQP-3、AQP-4和AQP-8的蛋白表達明顯減少(P< 0.01)，AQP-9表達無明顯變化。與模型組比較，地芬諾酯組、防風石油醚部位組、正丁醇部位組和總提取物組大鼠結腸組織AQP-3、AQP-4和AQP-8蛋白表達增加(P< 0.05或P< 0.01)，地芬諾酯組和防風石油醚部位組大鼠結腸中AQP-9表達明顯減少(P< 0.05或P< 0.01)(見圖2、表5)。

表5 防風不同極性部位對大鼠AQP-3、AQP-4、AQP-8和AQP-9表達的影響Table 5 Effects of different polarity extracts of S.divaricata on the expressions of AQP-3, AQP-4,AQP-8 and AQP-9 in = 10)

圖2 大鼠結腸中AQP-3、AQP-4、AQP-8和 AQP-9的表達情況Fig.2 The expressions of AQP-3,AQP-4, AQP-8 and AQP-9 in colon of rats

4 討論

腹瀉是由于各種因素造成腸道對水分的吸收功能下降或者分泌功能增強而導致大便含水量增加所致的腸道疾病，屬于中醫學“泄瀉”范疇，其病機為脾虛濕盛，運化功能失常，致使清濁不分、水濕下注而泄瀉。中醫認為濕勝則濡泄，而風能勝濕。風藥屬于法象藥理的稱謂，是具有祛風勝濕、升發清陽等作用，用于風邪致病的一類藥物。風藥氣輕味薄，性味多辛香走竄，因其溫燥之性而可祛濕。AQP是特異性跨膜轉運水的蛋白家族，參與水的吸收與轉運，與機體津液的生成、輸布、排泄關系密切。中醫認為，濕邪致病從其性狀上可分為有形可見的濕病如水腫、泄瀉和潛在不可見的濕病如風濕痹痛，但均與津液失衡有關，AQP可能是津液病證發生的生物學基礎[7]。基于“風能勝濕”的中醫理論，AQP可能是風藥治病的靶點。防風為風藥的代表藥物，以其升清燥濕之性用于治療泄瀉。因此，明確防風不同極性部位的止瀉作用及對結腸AQP的影響，有助于拓展風藥的臨床應用，也為開發相關藥物提供參考。

番瀉葉是常用的瀉下藥，其主要成分為番瀉苷、大黃酚、蘆薈大黃素及大黃酸等，能使腸蠕動增加，腸道對水等物質的消化吸收受抑制，并刺激腸道引起炎癥介質合成和釋放，使腸黏膜受損和促進大腸排空，瀉下作用顯著，因此被常用于藥理研究中腹瀉動物模型造模藥物[8]。本研究顯示，當大鼠灌胃番瀉葉至第5天時，大鼠腹瀉率已達100%；第7天時模型大鼠的體質量較正常大鼠明顯下降，腹瀉指數明顯升高。番瀉葉致瀉大鼠停止灌胃番瀉葉后有可能恢復正常，因此本實驗在第8天給藥時的同時繼續灌胃番瀉葉，以消除動物腹瀉癥狀自動恢復的影響。給藥結束后，地芬諾酯組、防風石油醚部位組、正丁醇部位組和總提取物組大鼠體質量較模型組大鼠增加，腹瀉指數降低，表明防風具有良好的止瀉作用，石油醚部位、正丁醇部位可能是其止瀉的有效部位。

腹瀉的發病機制研究發現致病因素激活腺苷酸環化酶，細胞內ATP轉化為cAMP，結腸Na+-K+-ATPase活性降低，促使腸黏膜細胞中K+流出，Na+、Cl-等進入細胞內，使細胞腫脹壞死，腸腔中水分明顯增加而引起腹瀉，導致電解質紊亂[9]。DAO是存在于腸道黏膜上皮細胞中的具有高度活性的細胞內酶，當腸黏膜細胞受損時DAO釋放入血，導致血清DAO活性升高，因此DAO的活性可反映腸道黏膜損傷程度，評價腸黏膜屏障功能的狀態[10]。腹瀉發生時腸黏膜受到損傷，巨噬細胞及T細胞被活化，促進TNF-α的合成和釋放，TNF-α進一步促進炎癥因子(如IL-1、IL-6等)分泌，加重腸黏膜損傷，致其水腫、充血并形成惡性循環[11]。本研究顯示番瀉葉誘導的腹瀉大鼠血清中Na+、K+和Cl-濃度明顯降低，DAO和TNF-α水平升高，結腸組織中Na+-K+-ATPase活性下降，病理形態學顯示結腸黏膜受損。地芬諾酯組、防風正丁醇部位組、石油醚部位組和總提取物組大鼠血清中Na+、K+和Cl-濃度不同程度升高，DAO和TNF-α水平降低，結腸組織中Na+-K+-ATPase活性增加，受損的結腸黏膜有不同程度的修復改善，表明防風石油醚部位、正丁醇部位和總提取物可修復受損的腸道黏膜，平衡電解質紊亂。

腸道是機體重要的水液轉運代謝器官，早期認為水在腸道的轉運取決于電解質產生的腸腔內外滲透壓差，現在研究發現結腸對水的重吸收是AQP介導的逆滲透梯度的主動吸收過程。AQP在腸道的異常表達是導致腸道對水分吸收減少繼而引發大量水分累積的關鍵因素，與腸道環境失衡密切相關[12]。目前已發現水通道蛋白的13個亞型(AQP0～AQP12)，表達于腸道的有11種，起主要作用的有AQP3、4、8和9。AQP3屬于具有相對選擇性的組成型水通道蛋白，除了水以外還可以轉運甘油、尿素，研究發現AQP3通過介導腸腔與血管之間的水液轉動調節結腸中的糞便含水量[13]；AQP4主要位于結腸上皮細胞的基底外側膜，作為高度選擇性的水通道蛋白，具有高度快速轉運水的能力，是其他水通道蛋白通透性的3～4倍[14]，將腸腔內的水分子轉運到腸道間質，在消化系統中起到很重要的作用；AQP8在結腸表達于黏膜吸收上皮細胞，參與結腸對水分的重吸收，在腹瀉患者結腸表達明顯降低，且結腸AQP8的表達越低，糞便含水量越高[15]；AQP9不僅參與結腸水液代謝，而且還可合成和分泌黏液，保護腸黏膜和潤滑大便，與便秘的發生相關[16]。本實驗顯示，腹瀉模型大鼠結腸AQP3、4、8表達下調，AQP9無明顯變化，說明AQP對腸道內水的重吸收具有重要意義，其表達異常是腹瀉形成的分子學基礎；地芬諾酯、防風石油醚部位、正丁醇部位和總提取物可提高腹瀉大鼠結腸組織AQP-3、AQP-4和AQP-8的蛋白表達；值得注意的是，地芬諾酯和防風石油醚部位可減少大鼠結腸中AQP-9水平，而防風總提取物對AQP9無明顯影響，推測防風的其他部位可能調控了AQP9的異常表達。上述結果表明防風及其石油醚部位、正丁醇部位可能通過調控結腸AQP的表達發揮止瀉作用，且石油醚部位與正丁醇部位對不同亞型的AQP調控具有差異。

綜上所述，防風具有較好的止瀉作用，其止瀉作用可能與提高Na+-K+-ATPase活性、修復黏膜損傷、調控腸道AQP表達有關，石油醚部位和正丁醇部位是防風止瀉的活性部位，且二者對腸道不同亞型的AQP表達具有差異。不同亞型的AQP調控機制不同，防風及其不同極性部位對AQP差異調控的機制有待進一步研究。