UPLC-Q-Exactive Orbitrap高分辨質譜定量分析不同產地、炮制前后女貞子中9種成分的含量

胡雁萍，趙 迪，李煥茹，馮志毅，李 柯，馮素香*

1河南中醫藥大學；2呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心；3鄭州市中藥質量控制與評價重點實驗室，鄭州 450046

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實，味甘、苦、涼，入肝、腎經，具有滋補肝腎、明目烏發之功效；可用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發早白、目暗不明、內熱消渴、骨蒸潮熱等[1]。女貞子中含有多種活性成分，如三萜類、環烯醚萜類、苯乙醇類、黃酮類、揮發油、糖類、氨基酸、甾醇類等[2,3]，具有抗糖尿病、抗腫瘤、護肝、抗氧化、抗炎、降糖、降脂、調節免疫等多種藥理作用，臨床上主要用于治療高脂血癥、骨質疏松、結腸癌、肺癌、肝炎等疾病[4-8]。女貞子中的主要活性成分為環烯醚萜苷類，但女貞子的藥效并不靠個別成分含量決定[9]，女貞子中的苯乙醇類、黃酮類、環烯醚萜等成分因具有抗氧化、抗骨質疏松等活性也被用于女貞子的質量評價[10,11]，但仍然不夠完善，通過分析與女貞子發揮藥效相關的化合物群的含量才能真正評價女貞子藥材的質量[11]。因此，本研究建立了同時測定女貞子中苯乙醇類(紅景天苷、松果菊苷)、黃酮類(槲皮素、芹菜素、蕓香苷、木犀草苷、木犀草素)和環烯醚萜類(橄欖苦苷、特女貞苷)等多種活性成分的含量測定方法，用于評價女貞子的品質。

女貞子的炮制方法始見于宋代《瘡瘍》一書，女貞子傳統的炮制品沿用至今的有生品、酒制品，現代還增加了凈制品、蒸制品、鹽制品、醋制品等，臨床上常用生品和酒制品，女貞子生品清肝明目、滋陰潤燥，酒制后滋補肝腎作用顯著增強[12]。研究表明，女貞子酒制后補肝腎作用增強與女貞子中環烯醚萜苷類成分在炮制過程中發生水解轉化密切相關[13]，女貞子經炮制后環烯醚萜類苷類成分和苯乙醇苷類成分含量降低，紅景天苷和苯乙醇苷元含量升高[14]。但是，這些研究比較零散，不具有系統性，不足以科學的評價女貞子炮制前后化學成分的變化。鑒于此，本研究采用UPLC-Q Exactive-Orbitrap高分辨質譜建立同時測定女貞子中紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷的含量，分析不同產地女貞子中化學成分的分布規律，考察炮制前后女貞子中化學成分含量的變化，以期為規范女貞子飲片、炮制品的質量標準提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜-四極桿-靜電軌道阱-高分辨質譜儀(Q-Exactive，美國Thermo Scientific公司)；Xcalibur質譜工作站；MS105DU型十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒儀器有限公司)；AL204型萬分之一天平(梅特勒-托利多上海儀器有限公司)；KH-250E型超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；Milli-Q POD超純水儀(Merck公司 德國)。

1.2 試藥

紅景天苷(批號：MUST-16041802，純度：98.96%)、蕓香苷(批號：MUST-16031712，純度：98.87%)、木犀草苷(批號：MUST-14060918，純度≥98%)、特女貞苷(批號：MUST-16021904，純度:98.01%)、橄欖苦苷(批號：MUST-16052512，純度：99.72%)、木犀草素(批號：MUST-14050411，純度≥98%)、芹菜素(批號：MUST-14050505，純度≥98%)、槲皮素(批號：MUST-15042714，純度：98.94%)、松果菊苷(批號：MUST-17030701，純度：98.88%)，均購自成都曼思特生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，均購自美國Fisher公司；水為超純水；磷酸為分析純，購自洛陽昊華化學試劑有限公司；黃酒(5年)購自浙江古越龍山紹興酒股份有限公司。

女貞子采集于不同地區，經河南中醫藥大學生藥學科謝小龍副教授鑒定為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實。樣品信息來源見表1，樣品均于2017年1月份采收。

表1 樣品信息 Table 1 Sample information

續表1(Continued Tab.1)

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

取22批不同產地女貞子藥材，按“2020版《中國藥典》四部通則0213燉法”進行女貞子藥材的炮制。炮制方法為：取女貞子藥材約100 g，加入黃酒20 g，拌勻，密閉悶潤4 h，在悶潤過程中，每隔半小時攪拌一次，置于蒸鍋中，密閉，蒸汽加熱燉制4 h，至女貞子呈黑褐色，取出，晾干備用。

2.2 供試品溶液的制備

取女貞子樣品粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加80%的甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取60 min(功率：700 W，頻率：40 kHz)，放至室溫，用80%的甲醇補足減失重量，濾過，蒸干。殘渣用80%的甲醇溶解并轉移至25 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別取紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含1.92、3.63、0.69、17.23、17.98、0.61、0.23、0.60、5.18 mg的混合對照品溶液，備用。

2.4 色譜、質譜條件

2.4.1 色譜條件

采用 Hypersll GOLD C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)，流動相為A：甲醇，B：0.1%(V/V)甲酸水溶液，梯度洗脫條件為：0～5 min：20%A；5～25 min：20%A→60%A，流速為0.2 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量5 μL。

2.4.2 質譜條件

離子源為加熱電噴霧離子化源(HESI)，載氣為氮氣，鞘氣壓力3.5 Mpa(35 bar)，輔助氣壓力1.0 Mpa(10 bar)，噴霧電壓+3.50、-2.80 kV，毛細管溫度為350 ℃，輔助器加熱溫度200 ℃，分辨率為70 000，負離子模式掃描。對照品和女貞子樣品的LC-MS色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)及女貞子樣品的色譜圖(B)Fig.1 Chromatogram of reference substance (A) and sample of Ligustri Lucidi Fructus (B)注：1.紅景天苷；2.蕓香苷；3.木犀草苷；4.特女貞苷；5.橄欖苦苷；6.木犀草素；7.芹菜素；8.槲皮素；9.松果菊苷。Note:1.Salidroside;2.Rutin;3.luteolin-7-O-glucoside;4.Specnuezhenide;5.Oleuropein;6.Luteolin;7.Apigenin;8.Quercetin;9.Echinacoside.

2.5 方法學考察

2.5.1 檢測限與定量限

取各對照品溶液適量，加入甲醇溶液逐步稀釋，以信噪比3∶1時對應待測物濃度為檢測限(LOD)，以信噪比10∶1時對應待測物濃度為定量限(LOQ)進行測定，結果見表2。

2.5.2 線性關系考察

精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液，加甲醇分別稀釋2、5、10、20、50、100、200、500倍，制成一系列濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取稀釋后混合對照品溶液5 μL，按照“2.4”項下條件測定，以各對照品峰面積(Y)對濃度(X)進行線性關系考察。

各個成分的線性回歸方程和線性范圍結果見表2，結果表明9個成分在一定濃度范圍內線性關系良好。

表2 9個成分線性實驗結果Table 2 Linear test results of nine components

2.5.3 精密度實驗

精密吸取同一混合對照品溶液，按照“2.4”項下色譜條件連續進樣6次，分別計算紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷峰面積的RSD值，結果顯示，9個成分峰面積的RSD值分別為：0.89%、1.12%、0.92%、0.77%、0.42%、1.18%、1.08%、0.87%、0.78%，表明儀器的精密度良好。

2.5.4 重復性實驗

取S2女貞子樣品6份，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下色譜條件測定，計算各成分含量的RSD值，測得9個成分含量的RSD值分別為：1.83%、3.36%、1.37%、1.57%、1.05%、2.57%、1.62%、2.15%、1.14%，表明該方法重復性良好。

2.5.5 穩定性實驗

取S2女貞子樣品，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，按照“2.4”項下色譜條件分別在0、1、2、4、8、12、24 h進樣，分別計算紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷峰面積的RSD值。結果顯示，9個成分峰面積的RSD值分別為：1.43%、1.69%、0.93%、0.70%、1.91%、1.05%、1.30%、2.08%、0.79%。表明供試品溶液在室溫條件下24 h內基本穩定。

2.5.6 加樣回收率實驗

取已知含量的女貞子(S2)藥材粉末6份，約1 g，精密稱定，分別按照含量比為1∶1精密加入相應量對照品溶液，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下條件測定，分別計算回收率及RSD值。實驗結果見表3，結果顯示各個成分加樣回收率的RSD值均<2.5%。表明該方法準確性良好。

表3 9個成分加樣回收率實驗結果Table 3 Test results of recovery rate of nine components

續表3(Continued Tab.3)

續表3(Continued Tab.3)

2.6 含量測定

2.6.1 不同產地女貞子中9個成分含量測定

取不同產地的干燥女貞子樣品，每個樣品平行制備3份，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下條件測定9個成分的含量，其含量測定結果見表4。

表4 不同產地女貞子中9個成分含量測定結果(n=3)Table 4 Determination results of nine components in Ligustri Lucidi Fructus from different habitats(n=3)(mg/g)

2.6.2 不同產地女貞子炮制后9個成分含量測定

取不同產地女貞子樣品按照“2.1”項下方法炮制，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下條件測定女貞子中9個成分的含量，其結果見表5和圖2。

表5 炮制后女貞子樣品9個成分含量測定的結果(n=3)Table 5 Determination results of nine components in Ligustri Lucidi Fructus after processing(n=3)(mg/g)

圖2 女貞子炮制前后成分含量比較Fig.2 Comparative of components content of Ligustri Lucidi Fructus before and after processing

2.7 主成分分析

主成分分析(PCA)是一種可以將多個變量通過線性變換來選出較少個數重要變量的多元統計分析方法，可被用來考察多個變量之間的相關性。由于同一藥材中很多成分結構相似且存在生源關系，所以其中成分的含量往往也存在相關性，主成分分析(PCA)則能夠對具有相關性的變量進行降維[15]。將22批不同產地女貞子、不同產地女貞子炮制后的紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷等9種化學成分的含量數據導入SIMCA14.1數據處理系統得到主成分分析得分圖(見圖3)，不同產地、不同產地炮制后的女貞子樣品被分為2類。

圖3 不同產地(A)、不同產地炮制后(B)女貞子的PCA得分圖Fig.3 PCA scores of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas (A) and after processing (B)

2.8 偏最小二乘法判別分析

偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)采用分類響應變量Y來提高類別間的分離，計算校正模型的數據包括校正誤差方根、交叉驗證誤差均方根以及測定的相關系數，采用SIMCA14.1軟件對22批不同產地女貞子、不同產地女貞子炮制后、不同產地女貞子炮制前后的9種化學成分的含量數據進行偏最小二乘判別分析。由圖4 PLS-DA得分圖可知，不同產地女貞子、不同產地女貞子炮制后的樣品可以分為2類，與主成分分析結果一致。VIP圖(見圖5、6)可以反映出每個成分在該模式下的貢獻程度，以VIP值>1為標準可知，特女貞苷、紅景天苷、木犀草苷、木犀草素、蕓香苷、橄欖苦苷、松果菊苷對產地劃分貢獻程度較大；特女貞苷、木犀草苷、蕓香苷、紅景天苷、木犀草素、松果菊苷對不同產地女貞子炮制后的劃分貢獻程度較大。木犀草苷、木犀草素、蕓香苷為不同產地女貞子炮制前后差異性的標志物。

圖4 不同產地(A)和不同產地炮制后(B)女貞子PLS-DA的得分圖Fig.4 Score of PLS-DA of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas (A) and after processing (B)

圖5 不同產地女貞子(A)、不同產地女貞子炮制后(B)女貞子中9種成分的VIP值Fig.5 VIP values of nine components of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas (A) and after processing (B)

3 討論

3.1 不同產地女貞子含量測定結果分析

本研究通過建立LC-MS法測定女貞子中9個成分含量測定方法，對不同產地的女貞子成分的含量進行測定。2020年版《中國藥典》規定特女貞苷的限量不低于0.70%，在所測22批不同產地的女貞子藥材中，有3個產地(河南新鄉、河北保定、河南輝縣)的女貞子藥材中特女貞苷的含量低于2020年版《中國藥典》含量限度，占13.64%。其原因有待進一步研究。在不同產地中，河南鄭州、湖北當陽、四川廣元、陜西楊凌、河南南陽、湖南長沙、湖南常德的紅景天苷和特女貞苷的含量較高，分別為0.986 2～1.544 0、12.850 0～18.106 6 mg/g。女貞子炮制后特女貞苷的含量明顯增加，均高于2020年版《中國藥典》含量限度。

圖6 不同產地女貞子炮制前后9種成分的VIP值Fig.6 VIP values of nine components of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas before and after processing

采用SIMCA14.1軟件對不同產地女貞子、不同產地炮制后的女貞子進行主成分分析，可將不同產地女貞子、不同產地女貞子炮制后各分為2大類，I類包括S2、S4、S6、S8、S13、S14、S15；Z2、Z4、Z6、Z8、Z13、Z14、Z15；II類包括S1、S3、S5、S7、S9、S10、S11、S12、S16～S22；Z1、Z3、Z5、Z7、Z9、Z10、Z11、Z12、Z16～Z22。由偏最小二乘判別分析中VIP圖可知，特女貞苷、木犀草苷、紅景天苷對產地劃分的貢獻程度較大，由分析結果可知，不同產地女貞子藥材質量差異較大，這可能與藥材的生長環境差異有關，單純測定1或2種成分的含量不能有效反應藥材的質量，需要對女貞子的多種成分同時測定，才能全面的反映其內在質量[16]。

3.2 女貞子炮制前、后含量測定結果分析

女貞子炮制方法有多種，其中最常用的方法為酒制，酒制又有酒燉法和酒蒸法。本研究采用了酒燉法初步探討女貞子在炮制過程中成分含量的變化。女貞子經酒燉后紅景天苷、特女貞苷、橄欖苦苷等含量明顯增加。可能由于酒制后改變其組織結構或成分的理化性質，有利于成分的浸潤、溶解、置換、擴散等溶出過程的進行，產生助溶作用，提高有效成分的溶出率[17]，其具體影響因素有待于進一步深究。木犀草苷、木犀草素、蕓香苷對女貞子炮制前后的劃分貢獻較大，研究表明，女貞子炮制后，特女貞苷水解成紅景天苷，炮制后的女貞子中紅景天苷含量明顯增加[18]。

本研究通過超高效液相色譜質譜聯用法建立了不同產地、炮制前后的女貞子中紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷9個成分含量測定的方法，相對于紫外測定，本研究方法分離能力強，靈敏度高，定性分析結果可靠，檢測限低。不同產地女貞子藥材質量差異較大可能與地域、氣候、土壤、生長年限和采收時間等因素有關，特女貞苷、木犀草苷、紅景天苷對產地劃分的貢獻程度較大。女貞子酒制后紅景天苷、特女貞苷、橄欖苦苷的含量明顯增加，可能由于酒制提高了有效成分的溶出率，具體原因有待深究。本實驗方法簡便、可靠，靈敏度高，為女貞子生品和炮制品的質量標準的完善和提高提供了參考。