茺蔚子中8-O-4′新木脂素類化學(xué)成分研究

彭 芳，熊 亮，何育霖，劉 菲*，彭 成

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室；2成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，成都 611137

茺蔚子為唇形科植物益母草(Leonurusjaponicus)的果實，“益母”之名最早載于《廣雅》：“益母，茺蔚也”，作為藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“茺蔚子”“味辛、微溫。主明目益精，除水氣。久服輕身，莖主癮疹癢，可作浴湯……”；前人多將益母草和茺蔚子混用，直至《本草綱目》記載“若治手、足厥陰血分風(fēng)熱，清瀉肝熱，明目益精，調(diào)女人經(jīng)脈，則單用茺蔚子為良。若治腫毒瘡瘍，消水行血，婦人胎產(chǎn)諸病，則宜并用為良……”[1]，茺蔚子和益母草最終發(fā)展成2個獨立的中藥，根據(jù)各自的側(cè)重優(yōu)勢用于不同的臨床癥候。

目前，對于益母草的植物化學(xué)研究較多，而對茺蔚子研究甚少。從茺蔚子中分離的化合物非常少，主要包含三萜、甾體、環(huán)肽及芳香族化合物等[2-7]。此外，一些文獻利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對其成分進行了分析，發(fā)現(xiàn)茺蔚子含有大量的脂肪族、單萜類等化合物[8-10]。但整體而言，對于茺蔚子化學(xué)成分的研究還較為匱乏。茺蔚子臨床用于治療月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉、痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀血腹痛、目赤腫痛、目暗不明、頭暈脹痛和原發(fā)性高血壓等[7]，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明。本實驗利用現(xiàn)代分離手段對茺蔚子的化學(xué)成分進行了研究。同時，通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，此類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝及抑制血小板活化因子(PAF)等生物活性[11,12]。故本實驗結(jié)合茺蔚子的傳統(tǒng)清肝功效，對其進行了抗肝癌和肝細(xì)胞保護活性篩選。以期闡明與茺蔚子傳統(tǒng)功效相關(guān)的現(xiàn)代藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為茺蔚子臨床用藥提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Synapt G2HDMS型高分辨質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；Burker-AVIIIHD-600型核磁共振波譜儀[測定溫度297 K(24 ℃)，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)，德國Bruker公司]；341 plus型旋光儀[珀金埃爾默儀器(上海)有限公司]；Agilent Cary 600 FT-IR型紅外光譜儀和1220型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Chirascan-plus circular dichroism型光譜儀(英國應(yīng)用光物理公司)；Búchi Rotavapor R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和Búchi Gradient Former B-687型中壓液相色譜儀(瑞士Búchi公司)；ZF-90型多功能暗箱式紫外透射儀(上海寶山顧村電光儀器廠)；Milli-Q Reference型超純水儀(德國默克集團)；AL 104型電子天平(瑞士Mettler Toled公司)；Multiskan MK 3型酶標(biāo)儀和Series II Water Jacket型CO2孵箱(美國Thermo公司)；Allegra X-12R型離心機(美國Beckman Coulter公司)；AE 2000型電子顯微鏡(廈門Motic公司)。

十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱[月旭科技(上海)股份公司，40～60 μm]；D101型大孔吸附樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司)；柱色譜硅膠H和薄層色譜硅膠GF254(青島海洋化工廠)；對乙酰氨基酚(成都克洛瑪生物科技有限公司，批號CHB180228)；DMEM培養(yǎng)基[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，批號2003938]；青霉素-鏈霉素溶液(100X，上海碧云天生物技術(shù))；新生牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號18060403)；胰蛋白酶(1:250，北京索萊寶科技有限公司，批號920T042)；噻唑藍(MTT，北京金泰宏達生物科技有限公司，CAS 298-93-1)；氘代甲醇(CD3OD)、氘代丙酮[(CD3)2CO]和氘代氯仿(CDCl3)[美國劍橋CIL(同位素標(biāo)準(zhǔn)品)公司]；色譜甲醇(美國Sigma公司)、二甲基亞砜、二氯甲烷(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)。

SMMC-7721人肝癌細(xì)胞、HL-7702人肝正常細(xì)胞、Chang人肝正常細(xì)胞均由美國博士德生物科技有限公司提供；茺蔚子藥材于2016年9月購自四川省成都市荷花池藥材市場，由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室高繼海副教授鑒定為唇形科植物益母草Leonurusjaponicus的果實，標(biāo)本現(xiàn)存于成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，標(biāo)本號SCWZ-0917。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離

稱取茺蔚子藥材60 kg，加8倍量70%乙醇回流提取3次，每次2 h，將提取液合并，減壓回收溶劑后，得到浸膏3.5 kg。將浸膏分散于水中，再用乙酸乙酯萃取，回收溶劑得乙酸乙酯部位0.9 kg。剩余水部位用正丁醇萃取，回收溶劑得正丁醇提取物1.8 kg。正丁醇部位用D101型大孔樹脂進行分離，以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇(10%、30%、50%、70%、95%)進行梯度洗脫，回收溶劑得到5個洗脫部分(F1～F5)。采用堿性硅膠柱色譜(1% NaOH)對F2進行色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(50∶1～0∶1)為流動相進行梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并顯色相似的餾分，回收溶劑得到17個洗脫部分(F2-a～F2-q)。F2-o(23.0 g)通過反相中壓液相色譜以5%～100%甲醇-水溶液進行梯度洗脫，得到17個洗脫部分(F2-o-1～F2-o-17)。F2-o-12(1.1 g)經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇-水(50∶1∶0～3∶2∶0.25)為流動相進行梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜檢測，合并組成相似的餾分，回收溶劑得到12個洗脫部分(F2-o-12-1～F2-o-12-12)。F2-o-12-4再經(jīng)反相半制備液相色譜，以37%甲醇-水溶液洗脫，分離得到化合物2(2.3 mg，tR=50 min)，化合物3(1.7 mg，tR=69 min)。F2-o-12-6再經(jīng)反相半制備液相色譜，以42%甲醇-水溶液洗脫，分離得到化合物1(2.0 mg，tR=52 min)。

1.2.2 藥理活性篩選

SMMC-7721、Chang、HL-7702細(xì)胞用含10%滅活新生牛血清，1%青霉素-鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的SMMC-7721、Chang、HL-7702細(xì)胞株懸液，按3×103個/孔，每孔100 μL接種至96孔板，置于37 ℃，5% CO2，95%空氣的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞貼壁后，將孔板中的細(xì)胞分為空白組、模型組和給藥組(SMMC-7721不設(shè)模型組)，每組設(shè)6個復(fù)孔。空白組為含有1%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基；模型組為經(jīng)文獻[13]及預(yù)試驗確定的30 mmol/L對乙酰氨基酚，誘導(dǎo)損傷時間4 h；給藥組為30 mmol/L對乙酰氨基酚誘導(dǎo)損傷4 h后移去細(xì)胞上清液，加入濃度為50 μmol/L的待測成分(化合物1、2和3)，設(shè)6個復(fù)孔。繼續(xù)孵育24 h后每孔分別加入5 mg/mL MTT 20 μL。繼續(xù)孵育4 h后吸走上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)180 μL，充分震蕩，使紫色結(jié)晶充分溶解，在490 nm處測定吸光度(OD值)。分別按公式細(xì)胞抑制率=[(空白組OD值-給藥組OD值)/空白組OD值]×100%和細(xì)胞保護率=[(給藥組OD值-模型組OD值)/(空白組OD值-模型組OD值)]×100%計算細(xì)胞抑制率和細(xì)胞保護率。

2 實驗結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1的1H NMR(600 MHz)和13C NMR(150 MHz)數(shù)據(jù)Table 1 1H NMR (600 MHz) and 13C NMR (150 MHz) data of 1 in CDCl3 (δ in ppm)

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)式和HMBC、1H-1H COSY關(guān)鍵信號Fig.1 The structure,key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1

圖2 化合物1的ECD圖Fig.2 The ECD spectroscopic data of compound 1

化合物2白色粉末;易溶于二氯甲烷，薄層色譜(TLC)檢測有強暗斑，碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫紅色。ESI-MS：m/z427.1 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，(CD3)2CO)，δ：7.60(1H，d，J=15.6 Hz，H-7′)，7.36(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2′)，7.21(1H，dd，J= 7.8，1.8 Hz，H-6′)，7.17(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5)，7.11(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2)，6.90(1H，d，J= 7.8 Hz，H-5′)，6.77(1H，dd，J= 7.8，1.8 Hz，H-6)，6.45(1H，d，J= 15.6 Hz，H-8′)，4.90(1H，d，J=6.0 Hz，H-7)，4.38(1H，dtd，J=15.6，6.0，3.6 Hz，H-8)，3.94(3H，s，3-OMe)，3.82(3H，s，5′-OMe)，3.73(3H，s，9′-OMe)，3.53(1H，dt，J=12.0，6.0 Hz，H-9)；13C NMR(150 MHz，(CD3)2CO)δ：167.7(C-9′)，152.0(C-3′)，151.7(C-4′)，148.0(C-3)，146.8(C-4)，145.3(C-7′)，133.8(C-1)，129.3(C-1′)，123.3(C-6′)，120.5(C-6)，118.2(C-5′)，116.7(C-8′)，115.1(C-5)，112.0(C-2′)，111.4(C-2)，87.4(C-8)，73.6(C-7)，61.9(C-9)，56.4(5′-OMe)，56.2(3-OMe)，51.6(9′-OMe)。 以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的基本一致，鑒定為蘇式-甲基4-[2-羥基-2-(4-羥基-3-甲氧苯基-)1-(羥甲基)烷]阿魏酸。

化合物3白色粉末;易溶于二氯甲烷，TLC檢測有強暗斑，碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液顯色呈紫紅色。ESI-MS：m/z427.1 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.59(1H，d，J=15.9 Hz，H-7′)，7.15(1H，d，J=1.9 Hz，H-2′)，7.07(1H，dd，J= 8.4，1.9 Hz，H-6)，7.02(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，6.95(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，6.84(1H，dd，J= 8.1，1.9 Hz，H-6′)，6.70(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5′)，6.38(1H，d，J=15.9 Hz，H-8′)，4.81(1H，d，J= 5.9 Hz，H-7)，4.49(1H，td，J=5.7，4.0 Hz，H-8)，3.79～3.84(4H，overlapped，H-9，H-7′，H-8′，H-9′)，3.82(3H，s，3-OMe)，3.79(3H，s，5′-OMe)，3.76(3H，s，9′-OMe)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：169.5(C-9′)，151.8(C-3′)，148.7(C-4′)，147.1(C-3)，146.3(C-4)，144.7(C-7′)，134.0(C-1)，129.5(C-1′)，123.5(C-6′)，121.1(C-6)，117.6(C-5′)，116.5(C-8′)，115.6(C-5)，112.4(C-2′)，112.0(C-2)，85.5(C-8)，74.1(C-7)，62.4(C-9)，56.6(5′-OMe)，56.3(3-OMe)，52.0(9′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的基本一致，鑒定為赤式-甲基4-[2-羥基-2-(4-羥基-3-甲氧苯基-)1-(羥甲基)烷]阿魏酸。

2.2 藥理活性篩選結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)各化合物在給藥濃度為50 μmol/L時未表現(xiàn)出明顯抗肝癌活性，也無明顯肝細(xì)胞保護活性(見表2)。

表2 各個化合物細(xì)胞抑制率或保護率Table 2 Cell inhibition rate or protection rate of each

3 討論與結(jié)論

本實驗研究了茺蔚子中的8-O-4′新木脂素類成分及其抑制肝癌細(xì)胞和肝細(xì)胞保護活性，經(jīng)硅膠、凝膠柱色譜和反相中壓液相色譜等方法分離，再根據(jù)波譜數(shù)據(jù)分析鑒定出3個8-O-4′新木脂素類化合物，首次確定了化合物1的絕對構(gòu)型，化合物3是一個新的天然產(chǎn)物，化合物1、2和3均為首次從茺蔚子中分離得到。此研究豐富了茺蔚子的化學(xué)成分類型。

8-O-4′新木脂素類化合物的相對構(gòu)型主要依靠1H NMR中H-7與H-8的耦合常數(shù)來確定，該方法源于Wallis等[18]通過合成的方式得到的一對差向異構(gòu)體及其乙酰化產(chǎn)物，它們在CDCl3中H-7與H-8的耦合常數(shù)差別很大，赤式為2.5～3.5 Hz，而蘇式為6.8～8.4 Hz。然而，Gan等[19]提出在使用此方法時，必須考慮溶劑的影響。絕對構(gòu)型確證方法主要借助ECD法，其依據(jù)來源于Arnoldi等[20]合成的氧木脂素類似物(2R,3S)-3-methyl-2-phenyl-1,4-benzodioxane等，在210～250 nm處均有正的Cotton效應(yīng)。本文分離得到的化合物1在228 nm處有正的Cotton效應(yīng)(圖2)，并與文獻化合物的旋光進行對比確定其絕對構(gòu)型。此外，本實驗采用MTT法篩選了分離所得化合物對SMMC-7721肝癌細(xì)胞的抑制作用及其對對乙酰氨基酚所致HL-7702、Chang肝細(xì)胞的保護作用，在50 μmol/L時3個化合物均未表現(xiàn)出明顯的抗肝癌和肝細(xì)胞保護活性，但并不能由此得出茺蔚子中的木脂素?zé)o抗肝癌和肝細(xì)胞保護活性，研究者還將繼續(xù)研究其化學(xué)成分，以期獲得更多的化合物數(shù)量，進一步尋求其清肝明目功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。