亳菊內生菌BN7的鑒定與生防促生功能研究

陸 娟，唐 娟，王貴生，余梅霞,2，唐 俊,2*

1阜陽師范大學生物與食品工程學院；2環境激素與生殖發育安徽省重點實驗室，阜陽 236037

植物內生菌是指其生活史中某一階段或整個階段生活在健康的植物組織或細胞內并且沒有引起宿主明顯病害癥狀的一類微生物類群[1]。植物的整個生長過程就是宿主植物和內生菌共同體的生命過程[2]。內生菌與宿主植物及周圍的生活環境形成了比較復雜的生態關系。內生菌可以產生與宿主相似的代謝產物，并賦予植物抵抗生物和非生物脅迫的能力[3]。在內生菌與植物長期互作過程中，內生菌表現出了增強宿主植物對磷、鉀等礦質元素的分解和吸收的特性。篩選對植物病原菌具有拮抗作用又有解磷、解鉀、產生長素等多功能菌株在農業中具有較大的應用潛力。

菊花具有清熱消暑、抗氧化[4]的作用，同時還具有抑菌消炎[5,6]、減肥[7,8]和緩解高尿酸血相關的疾病[9]等功效。作為四大藥用菊花之一的亳菊，本課題組已對它的內生真菌進行了初步研究。本試驗對亳菊內生細菌BN7的抑菌、解磷、解鉀、促生、纖維素降解和抗氧化等活性進行研究，并且對其進行初步鑒定，為豐富生物防治資源和生物菌肥的研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

亳菊內生菌BN7，由阜陽師范大學王貴生等從亳菊中分離篩選獲得[10]，并保存于微生物實驗室。

1.2 供試病原菌

玉米彎孢菌(Curvularialunata)CY1、黃瓜枯萎菌(Fusariumoxysporum)FH1、小麥赤霉菌(Fusariumgraminearum)FM1、串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)F1、瓜炭疽菌(Colletotrichumlagenarium)CG1、茶葉輪斑菌(Pestalotiopsistheae)PC1，保存于阜陽師范大學微生物實驗室。

1.3 培養基

所用培養基有PDA培養基、LB細菌純化培養基，解有機磷培養基和無機磷細菌培養基，解鉀菌分離培養基[11]、解鉀液體培養基[12]、含有L-色氨酸的R2A培養基[13]、羧甲基纖維素鈉培養基[14]、羧甲基纖維素酶活(CMCase)檢測培養基[15]和濾紙酶活(FPase)檢測培養基[14]。

1.4 主要儀器與試劑

儀器：T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司，中國)；JS-680D全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司，中國)；T100 PCR儀(Bio-rad公司，美國)；ZWY-2112B恒溫培養振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司，中國)；Olympus-BX53正置熒光顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)。

試劑：鉬銻抗顯色劑、四苯硼酸鈉溶液、Salkowski比色液、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、PCR反應試劑盒、PCR產物純化試劑盒等均購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.5 拮抗植物病原菌的測定

將亳菊內生菌BN7及6種植物病原菌分別接種LB和PDA平板進行活化培養。平板對峙培養法測定亳菊內生菌BN7對玉米彎孢菌CY1等6種植物病原菌的抑菌活性，以未進行對峙培養的植物病原菌為空白對照，按照下面公式計算抑菌率，具體方法參考Wang等[10]的研究，抑菌率=[菌落半徑(CK)-菌落半徑(處理)]/[菌落半徑(CK)-2.5 mm]×100%。

1.6 解磷能力測定

將菌株BN7單菌落分別點種解有機磷、無機磷固體平板，37 ℃培養3天，觀察并測量解磷透明圈直徑。菌株BN7接種液體有機磷、無機磷培養基，150 rpm、28 ℃培養3天，鉬銻抗比色法測定培養液中可溶性磷含量[16]，以不接菌培養基為空白對照，以y=2.144 3x+0.000 4(R2=0.998)為標準方程，式中x為720 nm處吸光值，y為磷濃度。

1.7 解鉀能力測定

將菌株BN7在以鉀長石為唯一鉀源的解鉀菌分離培養基上劃線，37 ℃培養，若能生長，則該菌株有解鉀活性，以E.coli作為陰性對照。將菌株BN7接種解鉀液體培養基，28 ℃、160 rpm培養7天，以加等量滅活種子液為空白對照，測定菌濃度(OD600)，四苯硼鈉法測定培養液中水溶性鉀含量[17]，以y=118.68x(R2=0.991 9)為標準方程，式中x為420 nm處吸光值，y為鉀濃度。

1.8 產IAA能力測定[13]

將BN7菌株接種含有L-色氨酸的R2A液體培養基，搖床培養4天，取1 mL菌懸液加入1 mL Salkowski比色液(50 mL 35% HClO4+ 1 mL 0.5 mol/L FeCl3)，以在比色液中加入1 mL 50 mg/L的植物生長激素(IAA)作為陽性對照，室溫避光放置30 min，顏色變粉紅者為陽性，表示能夠分泌IAA，顏色越深表示分泌的IAA越多，不變色為陰性。Salkowski比色法測定BN7菌株發酵液中IAA含量，以y=0.018 8x+0.002 7(R2=0.995 2)為標準方程，式中x為IAA濃度，y為530 nm處吸光值。

1.9 纖維素降解能力測定

方法參考Wang等[10]的研究。將BN7菌株點種羧甲基纖維素鈉培養基平板，37 ℃培養4天，剛果紅染色，通過透明圈直徑與菌落直徑比值的大小定性測定BN7菌株纖維素降解能力的強弱。將BN7菌株接種CMCase檢測培養基及FPase檢測培養基，分別振蕩培養7天，每隔24 h取樣一次，DNS法測定上清液中的葡萄糖含量，以y=0.177 6x+0.005 6(R2=0.998 5)為標準方程，式中y為葡萄糖，x為530 nm處吸光值，定量檢測CMC酶活及FPase酶活[14，15]。酶活力單位的定義：以每毫升發酵上清液酶促反應30 min釋放1 μg葡萄糖的量為一個酶活單位(U)。

1.10 DPPH清除能力的測定

將BN7接種LB液體培養基，37 ℃、160 rpm培養7天，6 000 rpm離心10 min，取上清液，經0.22 μm無菌濾膜過濾得無菌發酵液，測定并計算發酵液清除DPPH的能力，具體方法同文獻[10]，以y=9.295 6x+0.004 3(R2=0.999 6)為標準方程，式中y為517 nm處吸光值，x為DPPH濃度。

1.11 菌株鑒定

1.11.1 形態學觀察

將菌株BN7在LB平板上劃線培養24 h，觀察菌落大小、顏色、形狀等特征，并進行革蘭氏染色、芽孢染色。

1.11.2 生理生化鑒定

參照《常用細菌系統鑒定手冊》[18]和《伯杰細菌鑒定手冊》[19]，對BN7進行生理生化鑒定，包括產酸產氣試驗、甲基紅試驗、VP試驗、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原作用試驗、精氨酸雙水解酶和誘導產生青霉素酶試驗等。

1.11.3 分子生物學鑒定

采用CTAB法提取內生菌BN7總DNA，以總DNA作為模板，用細菌通用引物進行PCR擴增，引物序列及反應體系參考Lu等[20]的研究。PCR反應程序依次為94 ℃(30 s)、52 ℃(30 s)、72 ℃(1.5 min)、72 ℃(10 min)，30個循環。反應結束后取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將純化的PCR產物送上海生工生物工程股份有限公司進行測序。根據測序結果，在GenBank數據庫中進行BLAST比對，搜索同源序列，選取有代表性菌株序列利用MEGA7.0軟件進行系統發育分析，NJ法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株BN7拮抗植物病原菌的作用

亳菊內生菌BN7具有廣譜抗菌作用，對玉米彎孢菌CY1等6種植物病原菌均有抑制作用(見圖1和圖2)，抑制率在30%～68%之間，且對小麥赤霉菌FM1的抑制作用最強，抑制率為68.27%(見圖3)。

圖1 病原真菌在PDA平板上的培養特征Fig.1 Culture characteristics of pathogenic fungi on PDA plates注：A.玉米彎孢菌CY1；B.小麥赤霉菌FM1；C.串珠鐮刀菌F1；D.黃瓜枯萎菌FH1；E.瓜炭疽菌CG1；F.茶葉輪斑菌PC1；圖2、3同。Note:A.C.lunata CY1;B.F.graminearum FM1;C.F.moniliforme F1;D.F.oxysporum FH1;E.C.lagenarium CG1;F.P.theae PC1;Same forFig.2 and 3.

圖2 菌株BN7對6種病原真菌的拮抗作用Fig.2 The antagonistic activity of strain BN7 on six pathogenic fungi

圖3 菌株BN7對6種病原菌的抑制作用Fig.3 The inhibition effect of strain BN7 on six pathogenic fungi

2.2 菌株BN7解磷能力的測定

菌株BN7對無機磷和有機磷都有一定的溶解作用。有機磷的解磷圈(25.8 mm)比無機磷的解磷圈(17.3 mm)大，并且有機磷發酵液比無機磷發酵液中的可溶性磷含量高，分別為108.38 和68.71 mg/L，表明菌株BN7溶解有機磷效果較無機磷好。

2.3 菌株BN7解鉀能力的測定

在以鉀長石為鉀源的分離平板上，菌株BN7可以正常生長(見圖4)，但E.coli不能生長，表明菌株BN7具有解鉀菌的特性；在解鉀液體培養基中，菌株BN7比E.coli生長得好，并且菌株BN7發酵液的可溶性鉀含量(32.03 mg/L)比E.coli發酵液高(見表1)。

表1 菌株BN7的解鉀能力

圖4 解鉀平板上的菌株BN7Fig.4 Strain BN7 on potassium plate

2.4 菌株BN7產IAA能力的測定

在加入Salkowski比色液后，50 mg/L的IAA呈粉色，菌株BN7的R2A發酵液呈紅色，表明該菌株具有分泌生長素IAA的能力，根據標準曲線計算得出菌株BN7分泌的IAA高達164.39 mg/L。

2.5 菌株BN7纖維素降解能力的測定

菌株BN7可以在羧甲基纖維素鈉培養基上生長，經剛果紅染色后產生明顯的纖維素降解圈(見圖5)，37 ℃培養4天后降解圈直徑與菌落直徑的比值較大(2.17 ±0.582)，初步說明內生菌BN7具有較強的纖維素降解能力。菌株BN7接種CMCase和FPase檢測培養基后發酵培養1周，根據葡萄糖標準曲線計算發酵上清液的還原糖生成量并計算CMCase和FPase的活力。如圖6所示，菌株BN7發酵液上清的CMCase和FPase酶活都在第3天最高，分別為168.78 和79.87 U/mL。

圖5 菌株BN7的纖維素降解能力Fig.5 Cellulose degradation capability of strain BN7

圖6 不同培養時間菌株BN7的CMCase和FPase活力Fig.6 CMCase and FPase activity of strain BN7 at different incubation time

2.6 菌株BN7清除DPPH能力的測定

培養7天的菌株BN7發酵上清液對DPPH 自由基的清除率為82.13%，對照組Vc對DPPH自由基的清除率為93.5%，表明菌株BN7具有較強的清除DPPH能力。

2.7 菌株BN7的鑒定

菌株BN7菌落光滑，圓形，表面濕潤，易挑取，淡黃色，不透明，正反面顏色一致；細菌革蘭氏染色陽性，桿狀，鏈狀排列，芽孢中生(見圖7)。

圖7 菌株BN7菌落形態及芽孢染色Fig.7 Colony morphology and spore staining of strain BN7注：A.LB平板上的BN7；B.芽孢染色。Note:A.Colony morphology of strain BN7 on LB plate;B.Spore staining of strain BN7.

菌株BN7產酸試驗、淀粉水解試驗呈陽性，產氣試驗、甲基紅試驗、VP試驗、硝酸鹽還原作用試驗、精氨酸雙水解酶和誘導產生青霉素酶試驗等都呈陰性。

通過CTAB法提取獲得亳菊內生菌BN7基因組DNA片段，利用通用引物對其進行特異性擴增，獲得長約1 500 bp的條帶，經測序，該擴增產物的長度為1 427 bp，根據GenBank數據庫的基因序列構建生物進化樹，菌株BN7與相似度為99%的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)NBRC 15308聚在一起，它們的親緣關系最近(見圖8)。

圖8 基于NJ法構建的菌株BN7系統發育樹Fig.8 Phylogenetic tree of strain BN7 based on NJ method

因此，結合形態學觀察、生理生化試驗和16S rDNA結果初步將菌株BN7鑒定為巨大芽孢桿菌，Genbank登錄號為MW736394.1。該菌株已保存于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為GDMCC No.60467。

3 討論

20世紀70年代末期，Dobereiner等[21]發現固氮螺菌可以促進非豆科植物的生長；80年代后期加拿大的Philom Bios公司開始生產、銷售可以使小麥、油菜、豌豆等作物增產10%～15%的解磷菌劑、固氮菌劑和解磷固氮混合菌劑[22]。隨后，植物內生菌逐漸成為國內外研究的熱點。2009年，Cheng等[23]從華重樓中篩選得到一株內生菌PCE45，它產生的抗菌肽PCP-1對玉米彎孢菌Boed、稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)Cav等多種病原菌均具有抑制作用。2010年，Bressan等[24]從玉米植物組織中分離到6株可以產生幾丁質酶的內生芽孢桿菌，它們對串珠鐮刀菌都有抑制作用。2015年，Zhao等[25]從大豆根瘤中篩選出36株溶磷內生菌，其中菌株DD291發酵液中可溶性磷含量高達452 mg/L，并且，部分溶磷菌株對大豆的生長具有促進作用。2015年，Kang等[26]研究發現苜蓿內生菌ASR16、ALR33均能產生植物生長激素、嗜鐵素，具有溶解磷活性，對苜蓿的促生作用明顯。2018年，Gao等[27]從尼瓦拉野生稻中分離到57株內生細菌，其中44株內生固氮菌均有產生長素的能力，25株菌株具有不同程度的解鉀能力。2018年，Bai等[28]從野生黃精根莖中分離得到一株內生芽孢桿菌HJ-1，該菌對鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)均具有顯著抑菌作用。

目前，人們對亳菊內生菌的研究較少，對亳菊內生菌促生作用的研究也鮮為報道。本研究中的亳菊內生菌BN7對玉米彎孢菌CY1等6種植物病原菌均具有拮抗作用，對小麥赤霉菌FM1抑菌率最高，為68%。該菌株還具有一定的解磷、解鉀和產IAA的能力，分別為108.38、32.03和164.39 mg/L。菌株BN7解無機磷的能力(68.71 mg/L)約是樟樹內生巨大芽孢桿菌ZS-3(20.16 mg/L)[29]的3倍，可能與后者培養時間較短(24 h)有一定的關系；另外，菌株BN7產生長素的能力是郜晨等篩選的產生長素能力最強菌株N8(41.66 mg/L)[27]的4倍。菌株BN7還具有降解纖維素的能力，它的CMCase和FPase酶活在第3天分別為168.78 U/mL和79.87 U/mL。除此以外它清除DPPH自由基活性高達82.13%，遠高于先前篩選的亳菊內生真菌BJF10對DPPH的清除率(67.7%)[10]。根據形態學特征、生理生化試驗及對16S rDNA序列的分析，菌株BN7被鑒定為巨大芽孢桿菌。因此，巨大芽孢桿菌BN7是一株具有拮抗植物病原菌、解磷、解鉀和產生IAA能力的亳菊內生細菌，具有開發為生防促生菌劑的潛能。