地榆對急性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群的影響

李 麗，馮壯壯，王 慧，高晶淼，趙汗林，王艷煒，張睦清,*

1河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，石家莊 050017；2河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200；3河北省中醫(yī)院，石家莊 050011

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種伴有免疫異常的非特異性炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，病程綿長易反復(fù)，主要表現(xiàn)為慢性結(jié)腸粘膜炎癥導(dǎo)致的腹瀉、腹痛、出血等癥狀，不僅影響患者生活質(zhì)量，長期反復(fù)的粘膜損傷更易增加患者患結(jié)腸癌風(fēng)險[1]。近年來，UC發(fā)病率逐年上升[2]，已成為影響人們生活和健康的一個全球性疾病。雖然目前UC的發(fā)病機制仍未完全闡明，但廣泛認(rèn)為其是多因素(如環(huán)境、遺傳、免疫、感染等)共同引起的一種綜合疾病反應(yīng)[3]。腸道菌群作為腸道內(nèi)部環(huán)境的主要組成部分，對腸道代謝、免疫、炎癥等多方面生理病理過程發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變與UC的疾病進(jìn)程關(guān)系密切[4]，UC患者的腸道菌群紊亂失衡，而移植正常菌群后腸炎癥狀可明顯緩解[5]，說明腸道菌群對UC的發(fā)病和治療有重要調(diào)節(jié)作用。

地榆(SanguisorbaofficinalisL.)是薔薇科地榆屬多年生草本植物，以根入藥，具有止血涼血、解毒斂瘡的功效，可用于便血，痔血，血痢，崩漏，水火燙傷及癰腫瘡毒的治療。近年來，地榆及其復(fù)方制劑，如地榆三白湯、冰及地榆湯等均顯示出較好的UC臨床治療效果[6-8]，但是由于UC發(fā)病機制復(fù)雜，地榆治療UC的機制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

因此，鑒于腸道菌群在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病進(jìn)程中的重要作用，本研究擬采用右旋葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的大鼠急性腸炎模型，通過高通量測序技術(shù)，探討地榆治療UC過程中的腸道菌群變化，以期從微生態(tài)角度闡釋地榆治療UC腸道炎癥的作用機制，為UC相關(guān)治療藥物的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持和方法參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自河北省實驗動物中心，合格證號SCXK(冀)2018-004。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ± 1 ℃，相對濕度45%～65%，12 h/12 h明暗交替。所有動物實驗遵循河北醫(yī)科大學(xué)有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.2 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulfate sodium salt，DSS，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；便隱血OB試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；大鼠IL-6 ELISA試劑盒、大鼠IL-1βELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；大鼠TNF-αELISA試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)；中藥地榆(北京同仁堂股份有限公司)經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室趙麗麗副教授鑒定為薔薇科地榆屬植物地榆SanguisorbaofficinalisL.的根。地榆稱重，于70 ℃、10倍水提取2次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，60 ℃減壓干燥得地榆提取物。

Centrifuge 5418型臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)；Epoch酶標(biāo)儀(美國BioTeK公司)；Chemray 240型全自動生化分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；PCR儀(美國Bio-rad公司)；Illumina Miseq測序平臺(美國Illumina公司)。

1.3 造模與給藥

Wistar大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組(control group，C)、模型組(model group，M)、地榆低劑量給藥組(low dosage group of Sanguisorbae Radix，SR-L)及地榆高劑量給藥組(high dosage group of Sanguisorbae Radix，SR-H)，每組6只。正常對照組飲用雙蒸水，模型組和地榆給藥組自由飲用3.5% DSS溶液7天造模。自第8天起，地榆給藥組每日灌胃給予地榆提取物，灌胃劑量以生藥量計分別為0.5 g/kg(SR-L)及1.0 g/kg(SR-H)，其他組灌胃給予同體積生理鹽水。連續(xù)給藥7天后，取材進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分

觀察并記錄大鼠體質(zhì)量、糞便性狀及便血情況，并參照文獻(xiàn)進(jìn)行DAI評分[9,10]。DAI評分由體質(zhì)量評分、糞便性狀評分、隱血評分組成。體質(zhì)量下降率評分：無減輕，0分；下降1%～5%，1分；下降5%～10%，2分；下降10%～15%，3分；下降>15%，4分。大便性狀評分：正常，0分；松散，2分；稀便，4分。便血評分：正常，0分；隱血，2分，肉眼可見血便，4分。以“(體質(zhì)量評分+糞便性狀評分+隱血評分)/3”計算各組小鼠的DAI評分。

1.5 大鼠結(jié)腸組織形態(tài)HE染色

取結(jié)腸遠(yuǎn)端組織，經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟制成蠟塊。使用輪轉(zhuǎn)式切片機制作大鼠結(jié)腸組織切片，并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(HE染色)，通過光學(xué)顯微鏡觀察大鼠結(jié)腸組織形態(tài)。

1.6 大鼠血清及結(jié)腸組織炎癥因子檢測

腹主動脈取血，室溫放置30 min，4 ℃下3 000 rpm離心10 min得上層血清。取大鼠結(jié)腸組織，用冰生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，取結(jié)腸遠(yuǎn)端腸段2 cm，精確稱重，加入生理鹽水在冰浴狀態(tài)下制備10%(m/V)的結(jié)腸組織勻漿液。將結(jié)腸組織勻漿液進(jìn)行細(xì)胞粉碎后，離心取上清。血清及結(jié)腸組織勻漿液采用ELISA試劑盒檢測炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α含量。

1.7 大鼠糞便取樣與腸道菌群檢測

給藥結(jié)束后，采用腹部刺激法收集各組大鼠的新鮮糞便，并用無菌鑷夾取放于無菌凍存管中，迅速置于液氮中保存，并送至上海歐易生物公司進(jìn)行大鼠糞便總DNA提取建庫、質(zhì)檢及測序，步驟如下。按照DNA抽提試劑盒說明書對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，采用特異引物343F和806R對V3-V4雙可變區(qū)進(jìn)行擴增[11]。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測、純化及定量。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，上機測序。測序數(shù)據(jù)質(zhì)控后以97%的序列相似度進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)劃分，并進(jìn)行多樣性分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 地榆對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體質(zhì)量及DAI指數(shù)的影響

如表1所示，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著下降(P<0.01)，DAI評分升高(P<0.01)；給予地榆治療后，低、高劑量組均可明顯改善DSS致UC大鼠的體質(zhì)量下降現(xiàn)象(P<0.01)，并降低DAI疾病評分(P<0.05)。以上結(jié)果說明，地榆對UC大鼠的疾病狀態(tài)有較好的改善作用，為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。

表1 地榆對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體質(zhì)量及DAI評分的影響Table 1 Effect of Sanguisorbae Radix on body weight and DAI score in ulcerative colitis rats = 6)

2.2 地榆對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響

如圖1所示，正常組大鼠結(jié)腸粘膜上皮完整，腺體和杯狀細(xì)胞排列整齊緊密，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠腸粘膜受損，腺體部分壞死或消失，排列紊亂，隱窩和杯狀細(xì)胞明顯減少，有大量炎性細(xì)胞浸潤。地榆給藥治療后，大鼠結(jié)腸粘膜上皮潰瘍明顯修復(fù)，腺體、杯狀細(xì)胞增多，排列較為整齊，炎癥細(xì)胞明顯減少。以上結(jié)果說明，地榆可修復(fù)DSS所致腸粘膜損傷，保護(hù)腸粘膜腺體及杯狀細(xì)胞，大鼠腸屏障作用明顯改善。

圖1 地榆對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響(HE染色，×200)Fig.1 Effect of Sanguisorbae Radix on pathological changes of colon tissue in ulcerative colitis rats (HE staining,×200)

2.3 地榆對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清及結(jié)腸組織炎癥因子的影響

對各組大鼠血清及結(jié)腸組織中炎癥因子進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示，與正常組比較，DSS模型組大鼠血清及結(jié)腸組織中IL-6、IL-1β及TNF-α含量均升高(P<0.05)。給予地榆治療后，大鼠血清及結(jié)腸組織IL-6、IL-1β及TNF-α含量顯著下降(P<0.05)，炎癥減輕。UC狀態(tài)下，結(jié)腸上皮屏障功能紊亂，可誘發(fā)炎癥因子的釋放[12]，而地榆可有效抑制炎癥因子的過量累積，提示其對UC的結(jié)腸炎癥有較好緩解作用。

圖2 地榆對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清及結(jié)腸組織炎癥因子的影響Fig.2 Effect of Sanguisorbae Radix on inflammatory factors of serum and colon in ulcerative colitis rats s,n = 6)注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with the control group,#P<0.05,##P<0.01;Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

2.4 地榆對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 地榆對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群α多樣性的影響

基于OTUs序列進(jìn)行菌群α多樣性分析，其中Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是衡量樣本中微生物多樣性的主要指標(biāo)。Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明群落的多樣性越高[13,14]。各組多樣性指數(shù)見表2，結(jié)果顯示，模型組大鼠腸道菌群Shannon指數(shù)顯著降低(P<0.05)，Simpson指數(shù)顯著升高(P<0.01)，菌群物種多樣性下降。給予地榆治療后，與模型組比較，地榆給藥組Shannon指數(shù)顯著提高(P<0.05)，Simpson指數(shù)顯著降低(P<0.05)，提示地榆對UC大鼠腸道菌群多樣性有一定恢復(fù)作用。

表2 腸道菌群α多樣性指數(shù)的變化Table 2 The changes of α diversity indexes of gut microbiota s,n = 6)

2.4.2 地榆對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群β多樣性的影響

在OTUs水平上基于未加權(quán)UniFrac距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析，繪制PCoA圖。主坐標(biāo)分析法[11](principal coordinates analysis，PCoA)，是一種降維排序方法，通過主坐標(biāo)分析可以實現(xiàn)多個樣品的分類，進(jìn)一步展示樣品間物種多樣性差異，兩點之間距離越大表明兩者的群落構(gòu)成差異越大。由圖3可知，模型組大鼠與正常組大鼠相對處于不同區(qū)域，表明其之間腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性存在差異。與模型組比較，地榆低、高劑量給藥組均距離正常組區(qū)域更近，說明地榆給藥后可減少模型組與正常組大鼠腸道菌群的差異。以上結(jié)果提示，UC大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性發(fā)生紊亂，給予地榆后，可一定程度調(diào)控并改善紊亂的腸道菌群，使其向正常方向改變。

圖3 腸道菌群β多樣性的主坐標(biāo)(PCoA)分析Fig.3 Principal coordinate analysis (PCoA) based on β diversity of gut microbiota

2.4.3 地榆對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道菌群分布及差異比較

為進(jìn)一步明確地榆對UC大鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的影響，本研究對基于門水平和屬水平的物種組成及差異進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4及圖5所示，正常組、模型組及地榆給藥組之間的菌群物種相對豐度，從門水平及屬水平上均存在差異。

圖4 門分類水平的腸道菌群分布(A)及差異比較(B、C)Fig.4 Composition (A) and differences (B,C) of gut microbiota at phylum level注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with the control group,#P<0.05,##P<0.01;Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

在門分類水平上(見圖4A)，6個主要優(yōu)勢菌門分別為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、Epsilonbacteraeota、及酸桿菌門(Acidobacteria)，以上6種菌門占總菌豐度99%以上。其中，變形菌門(Proteobacteria)相對豐度在各組中變化顯著(見圖4B)，在模型組中變形菌門豐度顯著上調(diào)(P<0.01)，給予地榆后，變形菌門相對豐度降低，其中高劑量給藥組與模型組有顯著性差異(P<0.05)。厚壁菌門及擬桿菌門是腸道菌群中的兩個優(yōu)勢菌門，兩者比值F/B(Firmicutes/Bacteroidetes)被證明與腸炎病程相關(guān)[15]。在UC模型組中F/B值顯著降低(P<0.05)，給予地榆后F/B值有所回升，其中地榆高劑量給藥組較模型組有顯著性差異(P<0.05)(見圖4C)。

在屬分類水平上(見圖5A)，相對豐度較高的菌屬為雙歧桿菌屬Bifidobacterium、擬桿菌屬Bacteroides、Alloprevotella、普雷沃氏菌屬PrevotellaceaeUCG-003、Prevotella-9等。對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，結(jié)果如圖5B所示，模型組擬桿菌屬Bacteroides、脫硫弧菌屬Desulfovibrio及Oscillibacter相對豐度顯著升高(P<0.05，P<0.01)，普雷沃氏菌屬Prevotel

圖5 屬分類水平的腸道菌群分布(A)及差異比較(B)Fig.5 Composition (A) and differences (B) of gut microbiota at genus level注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:Compared with the control group,#P<0.05,##P<0.01;Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01.

laceaeUCG-001和雙歧桿菌屬Bifidobacterium相對豐度顯著降低(P<0.01)。給予地榆后，以上菌屬相對豐度均可有效回調(diào)(P<0.05，P<0.01)，其中高劑量給藥組可將以上菌屬相對豐度調(diào)節(jié)回正常水平。以上結(jié)果表明，地榆可調(diào)節(jié)UC大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善菌群紊亂現(xiàn)象。通過促進(jìn)有益菌生長，降低致病菌豐度，使疾病大鼠腸道菌群向正常水平調(diào)節(jié)，可以修復(fù)腸道粘膜屏障，緩解炎癥[16]。

2.4.4 腸道菌群與炎癥因子關(guān)聯(lián)性分析

通過Pearson相關(guān)系數(shù)分析各組大鼠結(jié)腸組織炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α與主要差異腸道菌群的關(guān)聯(lián)性。相關(guān)性系數(shù)如表3所示，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌屬Bacteroides、脫硫弧菌屬Desulfovibrio及Oscillibacter相對豐度與結(jié)腸IL-6、IL-1β、TNF-α含量呈正相關(guān)；普雷沃氏菌屬PrevotellaceaeUCG-001和雙歧桿菌屬Bifidobacterium相對豐度與結(jié)腸IL-6、IL-1β、TNF-α含量呈負(fù)相關(guān)。其中，普雷沃氏菌屬、雙歧桿菌屬與IL-6相關(guān)性顯著(P<0.05，P<0.01)；變形菌門、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬與IL-1β相關(guān)性顯著(P<0.05，P<0.01)；脫硫弧菌屬與TNF-α相關(guān)性顯著(P<0.05)。以上結(jié)果顯示，菌群變化與腸道炎癥存在相關(guān)性。

表3 腸道菌群與炎癥因子的相關(guān)性分析Table 3 The correlation analysis between gut microbiota and colon inflammatory factors

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種起因復(fù)雜的炎癥性疾病，病情綿長易反復(fù)，需要長期有效的藥物治療。中藥經(jīng)過千年的臨床應(yīng)用，具有安全、有效、毒副作用小等特點，在治療UC等慢性病中具有獨特優(yōu)勢[17,18]。中藥地榆歸大腸經(jīng)，具有止血涼血、清熱解毒、收斂止瀉等功效，顯示出其對潰瘍性結(jié)腸炎的潛在治療作用。

本研究采用3.5%DSS自由飲用7天誘導(dǎo)建立大鼠急性UC模型，并從體質(zhì)量、DAI評分、組織形態(tài)學(xué)及炎癥因子水平等方面探討了地榆對UC大鼠腸道炎癥的改善作用。結(jié)果顯示，地榆可明顯提高UC大鼠體質(zhì)量，降低DAI疾病評分，并改善腸上皮粘膜損傷，恢復(fù)腸道腺體形態(tài)及緊密連接。IL-6、IL-1β及TNF-α作為常見的促炎因子，其含量與UC的疾病進(jìn)程密切相關(guān)[19]，因此本研究對大鼠血清及結(jié)腸組織IL-6、IL-1β、TNF-α含量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示模型組大鼠血清及結(jié)腸組織IL-6、IL-1β及TNF-α顯著升高，經(jīng)地榆干預(yù)后其含量明顯降低。上述研究結(jié)果表明，地榆對DSS誘導(dǎo)的大鼠UC有一定治療作用，可改善UC的腸道炎癥。

眾多研究證明腸道菌群結(jié)構(gòu)與UC疾病進(jìn)程具有相關(guān)性[20]。在無菌環(huán)境下，DSS或TNBS誘導(dǎo)的小鼠UC癥狀明顯低于有菌環(huán)境[21]。此外，UC患者腸道菌群豐度及多樣性降低，厚壁菌門等菌群比例下降，丙型變形菌及腸桿菌等菌群比例增加，UC患者的腸道失去了核心菌群的動態(tài)穩(wěn)定性[22]。進(jìn)一步向UC患者進(jìn)行菌群移植，發(fā)現(xiàn)移植正常糞便菌群后患者UC癥狀有明顯緩解[23]，說明腸道菌群結(jié)構(gòu)在UC的發(fā)病及治療中具有重要調(diào)節(jié)作用。傳統(tǒng)中藥多為水煎口服，不可避免要與腸道菌群接觸，但地榆是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群來發(fā)揮UC治療作用，目前尚不明晰。因此，本研究采用高通量測序技術(shù)對UC大鼠在地榆干預(yù)下的腸道菌群組成變化進(jìn)行了分析，旨在通過地榆對腸道菌群組成的影響，進(jìn)一步探討地榆治療UC的腸道機制。研究表明，模型組大鼠與正常組大鼠相比腸道菌群發(fā)生紊亂，菌群多樣性降低，經(jīng)地榆干預(yù)后，腸道菌群結(jié)構(gòu)一定程度得到恢復(fù)，腸道菌群多樣性亦明顯提高。與模型組比較，地榆可明顯上調(diào)PrevotellaceaeUCG-001和雙歧桿菌屬Bifidobacterium相對豐度(P<0.05，P<0.01)，顯著降低變形菌門(Proteobacteria)及擬桿菌屬Bacteroides、脫硫弧菌屬Desulfovibrio相對豐度(P<0.05，P<0.01)。通過相關(guān)性分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌屬Bacteroides、脫硫弧菌屬Desulfovibrio及Oscillibacter相對豐度與結(jié)腸IL-6、IL-1β、TNF-α含量呈正相關(guān)。其中，變形菌門是產(chǎn)生內(nèi)毒素的主要菌門之一，其相對豐度的增多易引起腸內(nèi)內(nèi)毒素增加，引發(fā)炎癥[24]。擬桿菌屬Bacteroides、脫硫弧菌屬Desulfovibrio及Oscillibacter均被認(rèn)為與UC腸道炎癥聯(lián)系密切[12,25,26]，可破壞腸道上皮粘膜功能。普雷沃氏菌屬PrevotellaceaeUCG-001和雙歧桿菌屬Bifidobacterium相對豐度與結(jié)腸IL-6、IL-1β、TNF-α含量呈負(fù)相關(guān)，此與前期相關(guān)研究一致[27,28]，PrevotellaceaeUCG-001及雙歧桿菌屬Bifidobacterium等益生菌相對豐度的升高將有利于保護(hù)腸道粘膜屏障功能，減輕炎癥反應(yīng)。經(jīng)地榆治療后，以上菌群的相對豐度均向正常組方向回調(diào)，提示地榆可以通過調(diào)節(jié)UC大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，加快菌群恢復(fù)，進(jìn)而緩解UC大鼠腸道炎癥癥狀。

綜上所述，地榆可能通過改善UC大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成，恢復(fù)菌群多樣性，修復(fù)粘膜屏障，進(jìn)而治療急性UC。本研究對地榆改善UC的腸道機制進(jìn)行了初步探討，可為地榆治療UC的臨床應(yīng)用及藥物開發(fā)提供一定數(shù)據(jù)參考。