流感病毒感染中炎癥小體的激活和調控機制

林裕貴，李程頤，李培群，鐘偉娟，林春秀，張增峰

流感是人類的主要傳染病之一，除了人流感病毒易感人類外，動物流感病毒也頻繁地跨越物種間的屏障向人類傳播，嚴重威脅人類健康和公共衛生安全。研究表明，炎癥小體是宿主抗流感病毒感染的重要機制之一，可以激活炎性半胱天冬酶(Caspase)分子，介導促炎細胞因子IL-1β和IL-18的分泌，參與機體的固有免疫和適應性免疫；但是炎癥小體過度激活也會激發嚴重的炎癥反應，導致組織器官免疫損傷，因此炎癥小體的激活及其調控機制已經成為當前研究的熱點。本文主要介紹流感病毒與炎癥小體的研究進展，重點介紹流感病毒感染過程中涉及到炎癥小體激活和調控的各種細胞和病毒因素，以期有助于流感病毒感染與宿主抗病毒免疫機制的研究。

1 流感病毒與宿主抗感染免疫概述

流感病毒屬正粘病毒科，是一種呈球狀或絲狀的分節段、單股負鏈RNA病毒，根據核蛋白(Nucleoprotein，NP)和基質蛋白(Matrix protein，M)的抗原特性不同可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)、丁(D)4種不同類型。其中，甲、乙、丙型流感病毒均能感染人，而最新發現的丁型流感病毒主要感染牛、豬等家畜，目前尚未發現其可感染人[1]。流感病毒中，甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)宿主范圍廣、變異速度快、流行范圍大、致病力強，因而對人類的危害最大。IAV基因組由8個分節段的RNA組成，編碼11種以上蛋白。根據病毒囊膜表面血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經氨酸酶(Neuraminidase，NA)的抗原性差異，IAV可進一步分為18種HA亞型(H1-H18)和11種NA亞型(N1-N11)，在人類流行的主要有H1N1、H2N2和H3N2亞型。人流感病毒主要感染上呼吸道組織，但持續感染時可感染細支氣管、肺泡等下呼吸道組織，從而引發病毒性肺炎；而禽流感病毒主要感染下呼吸道的肺泡[2]。機體的抗感染免疫包括固有免疫和適應性免疫：固有免疫由物理屏障和各種吞噬細胞、自然殺傷細胞以及機體分泌的干擾素(IFNs)等組成，在流感病毒感染的早期啟動并形成局部抗感染的免疫微環境；適應性免疫由T淋巴細胞和B淋巴細胞介導，主要依賴細胞毒性T淋巴細胞和中和抗體對被感染的細胞進行殺傷，在感染的中晚期聯合固有免疫共同清除病毒。值得注意的是，機體免疫引起的過度炎癥反應即“細胞因子風暴”(Cytokine storm)被認為是致病性流感病毒感染致死的主要原因[3]。在這一過程中，炎癥小體作為炎癥反應的關鍵啟動和調節分子發揮了重要作用。

2 炎癥小體在流感病毒感染中的作用

2.1 炎癥小體的保護性和損害性作用 炎癥小體是由一類具有識別病原體或細胞應激信號功能的胞質模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)參與組裝的多蛋白復合體[4]。現已發現與流感病毒感染相關的炎癥小體PRRs包括：NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)家族的NLRP3、AIM2樣受體(AIM2-like receptors，ALRs)家族的AIM2、維甲酸誘導型基因I(Retinoic acid-inducible gene I，RIG-I)以及粘病毒抵抗蛋白A(Myxovirus Resistant Protein A，MxA)。流感病毒感染研究表明，炎癥小體兼具保護性和損害性作用。研究發現，與野生型小鼠相比，NLRP3炎癥小體或Caspase-1缺陷小鼠的生存率顯著下降[5-7]，在此過程中，NLRP3炎癥小體促進了小鼠感染后的肺部損傷修復[5]，同時通過調節CD4+、CD8+T細胞以及B細胞介導的抗體生成而影響了適應性免疫[6]。此外，在流感病毒感染早期使用NLRP3抑制劑MCC950處理可以使小鼠生存率下降，然而在感染中后期使用MCC950處理則可以提高小鼠的生存率，表明NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應可能是影響流感病程的關鍵因素，在感染的不同階段起到不同作用[8]。但炎癥小體在致病性流感病毒感染中的作用則傾向于損害性，如1918年的流感大流行毒株和高致病性H5N1禽流感病毒，在猴子模型中誘導了依賴于NLRP3炎癥小體介導的細胞因子風暴，引發了強烈的肺部損傷[9-10]。此外，AIM2炎癥小體在兩個獨立的小鼠模型研究中也分別表現出了保護性和損害性作用[11-12]。總體而言，炎癥小體在流感病毒感染中的作用是一把雙刃劍，它所介導的炎癥反應對機體正確啟動固有免疫和適應性免疫都至關重要，但炎癥小體的過度激活可能導致嚴重的免疫病理損傷，甚至誘發細胞因子風暴。因此，深入了解機體和病毒對炎癥小體的激活和調控機制就顯得非常重要。

2.2 炎癥小體的結構和促炎機制 流感病毒激活的NLRP3、AIM2、RIG-I 以及MxA炎癥小體均屬于經典模型，主要由感受器蛋白PRRs、銜接蛋白凋亡相關的斑點樣蛋白[Apoptosis associated speck-like protein containing CARD(a caspase activation and recruitment domain)，ASC]和效應蛋白Caspase-1前體(Pro-Caspase-1)構成，PRRs被刺激激活后，可以通過接頭蛋白ASC上的Caspase募集結構域募集Pro-Caspase-1，Pro-Caspase-1隨后自我裂解為具有活性的Caspase-1，后者將Pro-IL-1β和Pro-IL-18加工成為成熟的IL-1β和IL-18，從而誘導炎癥反應[4]。此外，炎癥小體還能誘導一種嚴格依賴于Gasdermin(GSDM)蛋白家族介導的細胞焦亡，分為人源或鼠源Caspase-1通過炎癥小體介導的經典途徑和人源Caspase-4，5或鼠源Caspase-11直接結合脂多糖(LPS)介導的非經典途徑[13]。經典途徑中，焦亡的發生需要持續激活炎癥小體，產生的Caspase-1除了裂解Pro-IL-1β和Pro-IL-18，還裂解GSDMD產生具有細胞膜毒性的N端結構域(GSDMD-N)，從而導致細胞裂解和促炎因子釋放[14]。研究還發現，Caspase-3在化療藥物的作用下，也能作為炎性Caspase裂解GSDME引發焦亡[15]。

3 流感病毒介導炎癥小體的激活機制

流感病毒激活炎癥小體需要雙重信號[16]：第一信號是啟動信號，主要依賴于Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)和RIG-I樣受體(RIG-I-like receptors，RLRs)，通過識別病毒RNA和分泌促炎因子激活核因子κB(NF-κB)信號通路，上調Pro-IL-1β、Pro-IL-18和炎癥小體成分的轉錄表達；第二信號是組裝信號，即炎癥小體PRRs的激活，進而誘導炎癥小體的組裝活化。

3.1 TLRs的激活 人體中的TLRs包括TLR1-10，其中TLR3和TLR7/8(高度同源)可以分別感知流感病毒感染所產生的復制中間體雙鏈RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)和單鏈RNA(Single-Stranded RNA，ssRNA)，并分別通過含TIR結構域誘導β干擾素的接頭蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF)和髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor protein 88，MyD88)途徑介導抗病毒免疫反應[17]。不同細胞感染流感病毒后通過不同類型的TLRs激活炎癥小體，例如小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMMs)主要依靠TLR7來激活[18]，而正常人支氣管上皮細胞(Normal human bronchial epithelium，NHBE)主要依靠TLR3和RIG-I[19]。這可能與TLRs在不同細胞中的分布差異有關，NHBE中分布有TLR1-6，而TLR7幾乎不表達[20]。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR9則可以識別脂肽或肽聚糖、LPS、鞭毛蛋白以及含有未甲基化CpG的DNA序列(CpG-DNA)等多種細菌成分[17]，其對共生菌群的識別也是炎癥小體激活的第一信號的重要來源。感染流感病毒的小鼠經口服抗生素治療后能抑制NLRP3炎癥小體的激活，減少Pro-IL-1βmRNA、Pro-IL-18mRNA的轉錄以及IL-1β、IL-18的表達，而在使用不同類型的TLRs激活劑聚肌胞苷酸(Polyinosinic polycytidylic acid，Poly I:C)、LPS、鞭毛蛋白、CpG-DNA后能不同程度地恢復小鼠的免疫損傷[21]。腸道菌群對呼吸道抗流感病毒免疫也至關重要，完好的腸道菌群可上調小鼠TLR7信號通路，進而促進呼吸道中炎癥小體的激活，減輕流感病毒對呼吸道黏膜的損傷[22]。在流感病毒合并肺炎鏈球菌感染的小鼠模型中，肺炎鏈球菌可以激活TLR2，與流感病毒協同作用于NLRP3炎癥小體的激活[23]。此外，有研究發現流感病毒的功能RNA蛋白復合物可激活TLR10，并介導細胞因子和β-干擾素的生成[24]。

3.2 RLRs的激活 RLRs是胞質中一類可以識別異己RNA的RNA解旋酶，成員主要包括RIG-I、黑色素瘤分化相關基因5(Melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)和遺傳學與生理學實驗室蛋白2(Laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)。RIG-I和MDA5識別不同類型的RNA，RIG-I識別短鏈(<300 bp)dsRNA和病毒的含5′端三磷酸基團修飾的ssRNA(5′PPP-ssRNA)，MDA5則識別長鏈(>1 000 bp)dsRNA[25]。RIG-I和MDA5在識別出異己RNA后，通過結合下游線粒體抗病毒信號蛋白(Mitochondrial antiviral signaling adaptor，MAVS)激活NF-κB和干擾素調節因子(Interferon regulatory factor，IRF)IRF3/7信號通路，誘導細胞因子和IFNs的表達，產生抗病毒效應[25]。LGP2則通過結合RIG-I、MDA5起到免疫調節作用[26]，或協助RIG-I、MDA5與RNA的組裝[27]。有研究發現MDA5也參與了流感病毒感染的先天免疫應答，但其機制尚不明確[28]。此外，RIG-I還具有炎癥小體感受器的作用。研究發現，RIG-I是流感病毒感染人原代肺上皮細胞及NHBE細胞過程中主要的炎癥小體激活因子，IL-1β的分泌主要依賴于RIG-I，而非NLRP3；免疫共沉淀試驗進一步發現，與正常肺上皮細胞或NHBE細胞相比，流感病毒感染的細胞內RIG-I/Caspase1和RIG-I/ASC復合體明顯增加，表明RIG-I可獨立組裝成RIG-I炎癥小體[19]。

3.3 NLRP3的激活 NLRP3炎癥小體是現已知激活劑類型最多樣化的炎癥小體，可以識別各種病原體以及內源性分子引發的多種細胞損傷信號而激活，如細胞體積改變、溶酶體破裂、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)或線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)、K+外流以及Ca2+離子信號升高等[29]。研究表明，流感病毒也能有效地激活NLRP3炎癥小體，主要通過以下機制：1)病毒RNA激活：研究發現，流感病毒感染或轉染病毒RNA到小鼠或人源巨噬細胞，以及將純化的病毒RNA或RNA類似物Poly I:C直接注射到小鼠腹腔，都能誘導依賴于NLRP3的IL-1β分泌并引起炎癥反應，這表明流感病毒 RNA可以直接激活NLRP3炎癥小體[30]；但單純轉染病毒RNA時，NLRP3炎癥小體的激活程度要低于病毒感染[6]，提示NLRP3炎癥小體的激活還與其它病毒感染因素有關。2)線粒體激活：線粒體活性氧(Mitochondrial reactive oxygen species，mtROS)是NLRP3炎癥小體激活的一種機制，但研究發現流感病毒并不依賴mtROS來激活NLPR3炎癥小體，而是通過NLPR3和MAVS以線粒體膜電位依賴的方式與線粒體融合蛋白2(Mitofusin2，Mfn2)結合而激活[31]；但 mtROS可能參與了相關過程，小鼠感染流感病毒后使用mtROS抑制劑可以減輕氣道和肺部的炎癥反應，并降低其氣道IL-1β的表達[32]。3)PB1-F2(Polymerase basic protein 1-F2，PB1-F2)激活：PB1-F2蛋白是流感病毒表達的一種毒力因子，研究發現高分子量的PB1-F2蛋白聚合物能誘導NLRP3炎癥小體的形成，暴露在PB1-F2蛋白或感染表達PB1-F2蛋白的IAV都能引起小鼠強烈的炎癥反應[33]。此外，PB1-F2蛋白具有靶向線粒體的序列，來自致病性H7N9禽流感病毒的PB1-F2蛋白可以定位在線粒體上并誘導mtROS生成，從而激活NLRP3炎癥小體[34]。4)基質蛋白2(Matrix protein 2，M2)激活：流感病毒M2蛋白是一種具有離子通道活性的膜蛋白，當病毒復制時主要表達于細胞的膜系統。研究發現，M2蛋白可以通過在高爾基體反面網狀結構上轉出質子[18]或在細胞膜上介導K+外流[35]，引起細胞內離子濃度紊亂，激活NLRP3炎癥小體。5)Z-DNA結合蛋白1(Z-DNA-Binding Protein 1，ZBP1)激活：ZBP1是一種由IFNs誘導產生的多功能感受器，可以識別細胞內的DNA和RNA。最新研究發現，ZBP1還可以識別流感病毒的NP和聚合酶堿性蛋白1(Polymerase basic protein 1，PB1)，在流感病毒感染時通過兩個受體相互作用蛋白同型結構域(RIP homotypic interaction motif，RHIM)募集RIP激酶(RIPK)RIPK1和RIPK3介導不同的細胞死亡方式，ZBP1-RIPK1誘導細胞凋亡或壞死性凋亡，而ZBP1-RIPK3激活NLRP3炎癥小體誘導細胞焦亡[36]。RIPK1-RIPK3復合體還能激活動力蛋白相關蛋白1(Dynamin-related protein 1，DRR1)，并遷移向線粒體，導致線粒體損傷和NLRP3炎癥小體的激活[37]。(6)2′-5′寡聚腺苷酸合成酶/核糖核酸酶L(2′-5′ oligoadenylate synthetase/RnaseL，OAS/RnaseL)激活：OAS酶是IFNs誘導的抗病毒蛋白，能催化ATP合成2′-5′寡聚腺苷酸，激活RnaseL對流感病毒ssRNA的酶切活性，產生的RNA裂解產物再通過DHX33解旋酶和MAVS激活NLRP3炎癥小體[38]。見圖1。

圖1 流感病毒感染中NLRP3炎癥小體的激活機制

3.4 MxA的激活 MxA是IFNI誘導產生的一種廣譜抗病毒蛋白，最新研究發現MxA在呼吸道上皮細胞中能識別流感病毒NP，并通過GTP酶結構域與ASC結合，從而作為一個炎癥小體感受器發揮作用，用MxA轉基因小鼠感染IAV后，發現MxA能在感染早期引起呼吸道上皮細胞的快速炎癥反應，促進早期肺內IL-1β生成和粒細胞募集[39]。

3.5 AIM2的激活 AIM2是一種胞質感應器，能識別來自病毒、細菌或自身細胞損傷的dsDNA，在固有免疫反應中起著重要作用。研究表明，感染流感病毒的細胞可在死亡裂解后釋放出自身dsDNA，從而激活AIM2炎癥小體[11-12]。

4 機體對炎癥小體的調控和流感病毒的免疫逃逸

4.1 機體對炎癥小體的調控 炎癥小體受機體正、負兩個方向的調控，使機體既能有效清除病毒，又避免了免疫病理損傷。炎癥小體正調控機制中，主要是RIG-I-IFNs通路：流感病毒感染激活RIG-I引發IFN-I反應，而IFN-I與干擾素受體1(Interferon alpha/beta receptor 1，IFNAR1)結合后，能激發RIG-I、TLR3和NLRP3的表達，RIG-I激發后進一步促進IFN-I的表達，形成NLRP3炎癥小體和RIG-I激活的正反饋途徑[19]；此外，IFNs能誘導上文提到的ZBP1和OAS/RnaseL的表達和激活，進而激活NLRP3炎癥小體。但必須強調的是，IFNs也具有負調控炎癥小體的作用，因為其能有效抑制病毒復制，從而縮短炎癥時間和發生范圍。炎癥小體負調控機制中，主要是線粒體自噬：線粒體自噬是一種重要的自我調節機制，它能將損傷的線粒體通過自噬體轉運到溶酶體內進行降解，從而有利于維持細胞的穩態。研究發現，NOD2-RIPK2信號途徑能夠激活啟動線粒體自噬的關鍵分子UNC-51樣激酶1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)，從而清除損傷的線粒體；而敲除RIPK2或ULK1后，細胞的線粒體自噬功能降低，導致線粒體超氧化物增加而激活NLRP3炎癥小體[40]。

4.2 流感病毒對炎癥小體的免疫逃逸 當宿主與流感病毒在漫長的共同進化中發展出通過炎癥小體清除病毒的機制時，病毒也進化出了可以逃逸炎癥小體作用的機制。1)PB1-F2：研究發現，PB1-F2蛋白的長度差異可影響炎癥小體的激活，大部分致病性毒株表達的全長型PB1-F2蛋白可通過線粒體外膜轉位因子40(Translocase of the outer membrane 40，TOM40)向線粒體內膜空間轉移，PB1-F2蛋白的積累可減少線粒體內壁碎片的生成，從而抑制NLRP3炎癥小體的激活[41]。2)非結構蛋白1(Nonstructural protein 1，NS1)：流感病毒NS1蛋白對IFNs具有拮抗作用，它可以與IFNs途徑中的病毒RNA、RIG-I、TRIM(Tripartite motif，TRIM)蛋白TRIM25、切割與多聚腺苷酸化特異因子30 kDa亞基(CPSF30)等不同成分相互作用，從而抑制宿主IFNs反應[42]。NS1蛋白還可以抑制NF-κB通路，使ProIL-1βmRNA和ProIL-18mRNA的表達降低，以及通過其RNA結合區和TRIM25結合區靶向作用于NLRP3產生抑制效應[43-44]。

5 展望和總結

截至目前，大量研究肯定了流感病毒感染中炎癥小體的重要作用，尤其是在急性或重癥流感的不同階段，炎癥小體可能傾向于保護性或損傷性作用，這使得調控炎癥小體可能成為一種潛在的流感治療策略。據報道，在小鼠模型上已開展了大量相關研究，除了上文中的MCC950，還包括預防移植排斥藥物西羅莫司[45]，P2X7(Purinergic 2X7, P2X7)受體抑制劑丙磺舒和AZ11645373[46]等。其它研究也揭示了炎癥小體相關的激活和調控因子，如缺氧誘導因子-2α激活的長鏈非編碼RNA-NEAT1通過作用于Caspase-1促進炎癥小體的激活[47]；NIMA(Never in mitosis gene A, NIMA)相關蛋白激酶7被證明是激活NLRP3炎癥小體的關鍵上游蛋白[48]；波形蛋白促進炎癥小體的激活并與急性肺損傷中的炎癥和纖維化有關[49]；TRIM30通過調節ROS負性調控NLRP3炎癥小體的激活[50]；AIM2炎癥小體誘導細胞膜形成孔隙，進而引起K+外排，觸發NLRP3的非常規激活[51]等。但這些研究都不涉及流感病毒，因此這些激活和調控因子在流感病毒感染中的作用還有待明確。總之，進一步了解炎癥小體的激活和調控機制，可以加強我們對炎癥小體抗流感病毒感染作用的認識，并有助于開發流感治療的新策略。

利益沖突：無