甘肅省2縣犬感染利什曼原蟲影響因素分析

李 凡，余大為，楊成明，馮 宇，楊俊克，劉林林，關(guān)真平，張永福

內(nèi)臟利什曼病(visceral leishmaniasis,VL)又稱黑熱病(kata-azar),是一種通過白蛉叮咬傳播的人獸共患的寄生蟲病[1-2]。中國的黑熱病分為犬源型、人源型和自然疫源型[3-4]，甘肅是犬源型黑熱病主要的流行區(qū)[5-6]。人和犬的感染是利什曼病犬將利什曼原蟲傳播給健康的人和犬而導(dǎo)致[7]，人類病例往往集中在犬利什曼病發(fā)病率較高的地區(qū)[8]，而犬的感染往往先于人的感染[9]。一些國外學(xué)者開展了利什曼原蟲感染家犬的危險因素研究，但不同地點(diǎn)取得的研究結(jié)果差異很大[10]。課題組于2018-2019年在甘肅黑熱病流行區(qū)開展了以養(yǎng)犬家庭為基礎(chǔ)的調(diào)查，旨在了解犬源型黑熱病流行區(qū)犬感染的相關(guān)因素，為探討適合我國犬源型黑熱病防控的新方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查地點(diǎn) 選取近年來黑熱病病例較多的隴南市文縣中寨鎮(zhèn)興隆村和甘南州迭部縣洛大鎮(zhèn)洛大村作為調(diào)查現(xiàn)場。2個調(diào)查現(xiàn)場均位于河谷，生態(tài)環(huán)境相似、地理位置封閉，不易受其他村莊流動犬干擾。

1.2 調(diào)查方法 采用問卷方式對調(diào)查現(xiàn)場所有養(yǎng)犬家庭開展調(diào)查，調(diào)查犬主的年齡、性別、黑熱病防治知識知曉情況等內(nèi)容，記錄犬的位置、犬生活場所周圍的房屋條件，犬的來源、犬生活場所附近有無綠植等信息。同時采集受調(diào)查家庭犬靜脈血5 mL，注入加有乙二胺四乙酸鹽(EDTA)的采血管中，充分搖勻后4 ℃冷藏保存。所有受調(diào)查的犬主均同意調(diào)查資料和犬血液樣本在研究中使用。

1.3 檢測方法 采用PCR法進(jìn)行血樣檢測。試劑盒采用德國Qiagen公司DNeasy Blood &Tissue Kit，按照產(chǎn)品說明書步驟提取DNA。以RV1(5′-CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3′)和RV2(5′-CCACCTGGCCTATTTTACACCA-3′)為引物擴(kuò)增動基體基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小145 bp。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定觀察。檢測以病原學(xué)檢測確定的病犬靜脈血抽提DNA作為陽性對照，以在非流行區(qū)采集的家犬血液樣本作為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用EpiData3.1建立數(shù)據(jù)庫，采用IBM SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分類數(shù)據(jù)采用例數(shù)和率[n(%)]描述并采用卡方檢驗(yàn)，α=0.05；將檢驗(yàn)有意義的變量納入多元Logistic回歸分析，變量的篩選采用條件向后逐步回歸法。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2009-2017年文縣中寨鎮(zhèn)共報(bào)告黑熱病病例27例，迭部縣洛大鎮(zhèn)共報(bào)告26例。興隆村和洛大村海拔分別為1 400 m、1 680 m；年均溫度分別為5～15 ℃、8～11 ℃；人口分別有1 845人和1 640人。在2村共調(diào)查養(yǎng)犬戶445戶，取得調(diào)查問卷445份，并采集了537只犬的靜脈血。

2.1 PCR檢測 對現(xiàn)場采集的537只犬靜脈血進(jìn)行PCR檢測，利什曼原蟲PCR檢測陽性221只，陽性率41.15%(221/537)。其中文縣PCR檢測陽性率64.63%(95/147)，迭部縣PCR檢測陽性率32.31%(126/390)。

2.2 調(diào)查犬居住環(huán)境單因素分析 受調(diào)查的537只犬中有283只犬位置分布在村中央，有254只犬位置分布在村邊緣，分布在村中央和村邊緣的犬陽性率分別為33.92%(96/283)和49.21%(125/254)，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=12.923，P<0.05)。379只犬居住場所附近房屋墻面為磚混/粉刷墻壁，158只犬居住場所附近為土坯/石片墻壁，兩種條件犬的陽性率分別為30.99%(110/355)和60.99%(111/182)，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=44.723，P<0.05)。而犬舍與房屋距離遠(yuǎn)近、犬只來源方式及犬居住周邊環(huán)境有無綠植這3種因素與犬陽性率之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 犬利什曼原蟲感染環(huán)境單因素分析

2.3 犬主黑熱病防治知曉情況單因素分析 共調(diào)查犬主445人，有210人家中存在陽性犬。其中家庭存在陽性犬的犬主中，知曉犬是黑熱病傳染源的占42.96%(58/135)，不知曉占49.03%(152/310)，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.390，P>0.05)；知曉黑熱病傳播途徑的占為51.43%(72/140)，不知曉占45.25%(138/305)，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.472，P>0.05)；知曉黑熱病傳播媒介的占42.70%(76/178)，不知曉占50.19%(134/267)，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=2.405，P>0.05)，見表2。

表2 有陽性犬家庭犬主黑熱病防治知曉情況的單因素分析

2.4 犬感染利什曼原蟲多因素分析 根據(jù)調(diào)查犬居住環(huán)境和犬主黑熱病防治知曉情況單因素分析中χ2檢驗(yàn)結(jié)果，將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量犬的位置、犬舍附近房屋條件納入多元Logistic回歸模型中分析，篩選變量采用向后逐步法，納入標(biāo)準(zhǔn)為P=0.05，排除標(biāo)準(zhǔn)為P=0.10。擬合結(jié)果顯示犬的位置、犬主房屋條件被納入多因素回歸模型，見表3。

表3 犬感染利什曼原蟲影響因素的Logistic多因素分析

3 討 論

文縣和迭部縣是甘肅黑熱病主要流行區(qū)，兩縣地處甘肅南部，植被豐富，氣候溫和，是旅游、商業(yè)貿(mào)易的重要通道和目的地。黑熱病傳播季節(jié)外來人員多，流動頻繁，健康人感染風(fēng)險很大。因此了解犬源型黑熱病流行區(qū)犬感染的相關(guān)危險因素，有助于減少黑熱病的感染和傳播。

調(diào)查結(jié)果顯示在村莊邊緣位置的犬感染利什曼原蟲的風(fēng)險較高，這可能與當(dāng)?shù)孛浇榘昨攘?xí)性有關(guān)。甘肅本地的黑熱病傳播媒介中華白蛉具有野棲習(xí)性[11-12]，它們主要棲息于野外洞穴，黃昏時飛入村莊內(nèi)，吸血后再飛回野外。由于白蛉有飛行距離短的特點(diǎn)，使得分布在村莊邊緣的犬更容易被白蛉叮咬從而增加感染風(fēng)險。本調(diào)查還發(fā)現(xiàn)房屋條件較差的土坯/石片墻壁家庭的犬感染率更高，其感染風(fēng)險是磚混/粉刷墻壁居住條件犬的2.5倍，分析原因主要是土坯/石片墻壁表面粗糙、遍布孔洞縫隙，為白蛉躲藏和棲息提供良好的場所，增加了白蛉叮咬犬的機(jī)會。本次調(diào)查未發(fā)現(xiàn)陽性犬與周邊環(huán)境有無較多綠植之間存在相關(guān)性，與國外研究證明綠植豐富的環(huán)境會增加犬利什曼病感染風(fēng)險的結(jié)果不同[13]，可能與研究地點(diǎn)植物多為果樹，村民使用農(nóng)藥噴灑果樹有關(guān)。本次調(diào)查雖然發(fā)現(xiàn)陽性犬主對黑熱病防治知識的知曉率偏低，但未發(fā)現(xiàn)犬主防治知識知曉率與犬陽性率有關(guān)。

本次調(diào)查的缺憾是沒有對媒介白蛉開展密度調(diào)查，但根據(jù)熊光華研究結(jié)果，在甘肅南部白蛉密度隨著海拔的增高而遞減[14]，低溫能夠抑制白蛉卵發(fā)育，溫度對白蛉發(fā)育生長和種群分布有很大影響[15]。根據(jù)以上研究結(jié)果，文縣調(diào)查點(diǎn)海拔(1 400 m)較迭部縣調(diào)查點(diǎn)海拔(1 680 m)低，年均溫度(5～15 ℃)較迭部縣調(diào)查點(diǎn)(8～11 ℃)高，更有利于中華白蛉孳生繁育。1999年甘肅省疾控中心曾在迭部洛大村采用燈誘法在居民家開展媒介調(diào)查，中華白蛉密度0.5只/h。2006年，顧燈安等在文縣中寨采用同樣方法開展媒介調(diào)查，最多捕獲中華白蛉112只，密度14只/h[16]。以上研究資料均表明文縣白蛉數(shù)量比迭部縣多，密度高，因此這可能是文縣調(diào)查現(xiàn)場犬PCR檢測陽性率較迭部縣高的主要原因。

綜上所述，分布在村邊緣、犬居住環(huán)境為土坯/石片墻壁是影響犬感染利什曼原蟲的因素，這些因素充分說明環(huán)境因素在利什曼原蟲感染過程中的重要性。針對以上因素，在甘肅省犬源型黑熱病流行的地區(qū)，要向當(dāng)?shù)厝罕娦麄骱跓岵》乐浦R；督促居住在村邊緣的養(yǎng)犬戶經(jīng)常用殺蟲劑對犬舍和周邊墻壁進(jìn)行噴灑，重點(diǎn)噴灑土坯/石片墻壁，達(dá)到驅(qū)避和殺滅白蛉，減少白蛉對犬叮咬的目的；研究表明夏秋季晚間戶外活動頻率高的居民受感染風(fēng)險增加[17]，針對外來流動人員要開展預(yù)防白蛉叮咬的健康教育，讓流動人員夏季晚間外出要穿長袖衣服，涂抹防蚊驅(qū)避劑，盡量減少戶外活動以避免白蛉叮咬，減少黑熱病的傳播。

利益沖突：無