轉錄組分析布魯氏桿菌患者外周血免疫基因的表達情況

白賀霞，左明明，盤曉芳，趙新芳，韓璇雪

布魯氏桿菌病是世界上最常見的人獸共患傳染病之一，每年有 50多萬人感染布魯氏桿菌病。盡管人們已經努力嘗試控制布魯氏桿菌病的傳播，但它仍然世界上大多數地方流行，特別是在發展中國家[1-3]。布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌引起的[4-6]，人類是這種細菌的隨機宿主。我國所有省市自治區均有人感染布魯氏桿菌的病例報告，但發病人群仍以牧民為主。近些年來，新疆地區人和家畜的布魯氏桿菌病發病率均呈急速的高發病趨勢，據不完全統計每年新疆因布魯氏桿菌病導致的直接經濟損失可達上億元。

人類免疫系統與布魯氏桿菌之間的相互作用對于病原體的清除或存活是必不可少的[7-8]。先天免疫和適應性免疫反應都參與了對布魯氏桿菌感染的防控，這主要依賴于細胞介導的免疫反應。因此，抗原提呈細胞(巨噬細胞和樹突狀細胞)的貢獻以及CD4和CD8T淋巴細胞的誘導在這些免疫反應中起著至關重要的作用。大量證據及經驗表明，復雜疾病的特征受到多個基因相互作用的共同影響[9-12]。而目前對布魯氏桿菌病的免疫分子失調機制仍然未達成共識。需要更深入的研究來探討布魯氏桿菌感染過程中的免疫分子失調以及潛在的調控機制。

本文從GEO數據庫中獲取布魯氏桿菌病患者和對照組的基因表達譜數據，整合了對布魯氏桿菌病患者和健康人的外周血的免疫相關差異表達基因。通過生物信息學分析方法探討布魯氏桿菌病的關鍵失調免疫基因和分子機制。

1 材料與方法

1.1 數據來源 從美國國家生物信息中心(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GEO公共數據庫調取GSE69597獲取布魯氏桿菌病人及健康對照的全血轉錄組表達數據。

1.2 差異免疫基因的鑒定 使用R語言DESeq2對布魯氏桿菌病患者和對照之間的基因表達進行差異分析，設置篩選條件P<0.05鑒定差異表達基因(DEGs)。使用immport數據庫調取差異表達基因中免疫相關的基因集(immune-DEGs)。

1.3 免疫基因集GO和KEGG富集分析 使用Enrichr(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)在線富集工具對鑒定到的immune-DEGs進行生物功能(GO)和KEGG信號途徑分析。P<0.05為富集有統計學意義。

1.4 免疫基因集蛋白網絡互作分析(PPI)及核心(hub)調控基因的鑒定 我們將immune-DEGs上傳到STRING數據庫，并篩選綜合得分>0.4的蛋白質-蛋白質互作(PPI)網絡。用Cytoscape軟件(3.8.0版)鑒定PPI網絡中連接度最高的前10個基因為核心(hub)基因。

1.5 ROC曲線 我們使用SPSS 24.0對hub基因進行受試者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲線分析。曲線下面積越大，則基因的診斷能力越強。

1.6 樣本收集 各收集10例急性期首次確診的布魯氏桿菌患者及健康對照的外周血樣本。所有的樣本均獲得了患者的知情同意并獲得了昌吉市人民醫院的倫理委員會批準。

1.7 實時定量PCR(qRTPCR)檢測TNF和IFNG的mRNA水平 利用Trizol(Invitrogen)制備20例外周血樣本的總RNA。根據制造商的說明利用PrimescriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)逆轉錄為cDNA。用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒進行qRTPCR反應。以GAPDH 為內參基因，使用2-ΔΔCT的方法進行數據分析。所有的實驗均進行了3次重復。

1.8 單樣本基因集富集分析(ssGSEA) 我們使用ssGSEA算法來評估布魯氏桿菌患者及對照的全血中28種免疫細胞的免疫評分。P<0.05表明布魯氏桿菌患者與對照組之間的免疫細胞含量差異有統計學意義。

1.9 流式細胞術檢測Th1/Th2/Th17細胞和Treg細胞比例 取5例布魯氏桿菌患者和5例健康對照的100 μL EDTA抗凝外周血加入流式管中，分別加入5 μL流式抗體CD4-PECY7、CD25-BB515和CD127-PE用作Treg細胞的檢測；CD4-FITC、CD183-PECY5和CD196-PE用作Th1/Th2/Th17細胞的檢測，抗體均購自美國BD公司，混勻室溫避光孵育15 min后，加入溶血素2 mL。室溫孵育5 min后，1 500 r/min離心5 min，PBS洗1遍后，加入300 μL PBS重懸上流式機(美國貝克曼，DXflex)檢測。

2 結 果

2.1 差異免疫基因的鑒定 我們共鑒定到布魯氏桿菌病患者與對照之間的差異表達的基因(P<0.05)有4 924個，其中上調表達基因2 510個，下調基因2 414個。通過immport數據庫篩選出免疫相關的差異表達基因共390個，上調基因208個，下調基因182個。見表1，展示了上調和下調變化倍數最大的前十個差異表達基因。

表1 差異表達基因

2.2 免疫基因的GO和KEGG富集分析 GO功能注釋分析結果表明，對于390個 免疫相關mRNAs的靶點，生物過程(BP)最豐富的術語是“cytokine-mediated signaling pathway(細胞因子介導的信號通路)”(圖1A)和“cellular response to cytokine stimulus(細胞對細胞因子刺激的反應)”，細胞組分(CC)中的“integral component of plasma membrane(質膜的組成部分)”和“T cell receptor complex(T細胞受體復合物)”(圖1B)，以及分子功能(MF)中的“cytokine receptor activity(細胞因子受體活性)”和“protein tyrosine kinase activity(蛋白酪氨酸激酶活性)”(圖1C)。KEGG途徑分析結果表明，富集最高的幾條通路是T cell receptor signaling pathway(T細胞受體信號通路)，B cell re-ceptor signaling pathway(B細胞受體信號通路)，Th17 cell differentiation(Th17細胞分化)(圖1D)。

注：A差異基因參與的生物學進程；B差異基因參與的細胞成分；C差異基因參與的分子功能；D差異基因參與的信號通路

2.3 免疫基因集PPI和hub基因的鑒定 為了在上述390個免疫相關差異表達基因中識別hub基因，我們篩選了在PPI網絡中連接度最大的前10個基因(圖2A)。包括TNF、IL6、AKT1、IL4、TLR4、CTLA4、IFNG、STAT1、TLR2和CD86。與正常對照(Control)組相比，IFNG、STAT1、CTLA4和TNF在布魯氏桿菌患者組中顯著高表達，其余的則是低表達(圖2B)。

A：預測到的hub基因；B：預測的hub基因mRNA表達水平柱狀圖；①：P<0.05；②：P<0.01；③：P<0.001。

2.4hub基因的ROC曲線 ROC曲線結果顯示，IFNG的曲線下面積大于0.7，說明其對布魯氏桿菌病具有良好的診斷意義，其余基因的曲線下面積均小于0.7，見圖3。

圖3 hub基因ROC曲線

2.5 關鍵基因的驗證 收集布魯氏桿菌病患者和健康對照的外周血樣本，利用qRTPCR的實驗方法檢測IFNG和TNF的mRNA水平。結果發現，與對照組比較，IFNG和TNF在布魯氏桿菌病患者中表達上調有統計學意義(P<0.05)(圖4)。進一步說明他們對布魯氏桿菌病具有良好的診斷意義。

①：P<0.001

2.6 單樣本基因集富集分析(ssGSEA) 單樣本基因集富集分析結果顯示全血中與control(對照組)組相比Activated CD4T(活化型CD4T細胞)、Effector memeory CD4T(效應型CD4T細胞)、Effector memeory CD8T(效應記憶型CD8T細胞)、Type 2 T helper(2型T輔助細胞因子-Th2)在布魯氏桿菌病患者組有顯著上升；而效應型B細胞(Activated B)、嗜酸性粒細胞(Eosinophil)、未成熟B(Immature B)、巨噬細胞(Macrophage)、記憶B(Memory B)、自然殺傷T細胞(Natural killer T，NKT)、中性粒細胞(Neutrophil)、漿細胞樹突狀細胞(Plasmacytoid dendritic)、調節性T細胞-Treg(Regulatory T)則下降，見圖5。

①：P<0.05；②：P<0.01；③：P<0.001；ns：無差別

2.7 流式細胞術驗證Th1/Th2/Th17細胞和Treg細胞比例 流式結果顯示，與健康對照組相比，布魯氏桿菌病患者外周血中Th2和Th17細胞比例增高，而Th1細胞和Treg細胞比例則降低，見圖6。

A：Th1/Th2/Th17細胞比例；B：Treg細胞比例

3 討 論

隨著全球對布魯氏桿菌病研究的深入，發現免疫損傷在該病的發生發展，尤其是慢性化中起重要作用[13]。宿主免疫反應在功能上分為先天性和適應性免疫。而布魯氏桿菌為胞內寄生菌，故以適應性細胞免疫為主[14]。而適應性免疫由T淋巴細胞(細胞免疫)以及B淋巴細胞(體液免疫)組成[15]。我們的分析結果發現，活化和未成熟型B細胞在布魯氏桿菌患者顯著低表達，而活化的CD4+T細胞和CD8+T細胞均在人布魯氏桿菌病患者中顯著高表達。布魯氏桿菌感染宿主后，人體對病原學的清除，主要是T淋巴細胞在其中發揮了關鍵作用。T淋巴細胞由不同的細胞亞群組成，各亞群T細胞通過分泌動態平衡的多種不同細胞因子來維持人體正常的免疫功能，一旦這種平衡被打破就可以導致機體內免疫紊亂[16]。作為適應性免疫應答的一部分,CD8+T細胞通過鑒定和殺死受損宿主細胞來控制細胞內感染[17-18]。CD4+T細胞在外來抗原作用下分化為各種效應T細胞參與免疫應答。Zheng等[19]研究發現，與健康受試者個體相比，人布魯氏桿菌病患者中CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例顯著升高。因此，我們認為人布魯氏桿菌病患者存在T淋巴細胞免疫功能異常，CD4+T和CD8+T細胞可能是影響布魯氏桿菌病進展的重要因素。

另一方面，本研究通過PPI網絡鑒定了10個hub基因。其中，IFN-γ和TNF在布魯氏菌病患者中顯著高表達，TNF在PPI網絡中處于最核心的調控地位。當人體感染病原體后，在不同的細胞因子和環境作用下，CD4+T細胞可以分化成不同類型細胞，如Thl，Th2，Thl7，Treg等細胞亞群釋放IFN、TNF、IL-4等細胞因子，進一步誘導細胞免疫或體液免疫應答[20]。在Mosmann描述Th1/Th2“二分法”概念中，布魯氏桿菌病再次被用作感染與干擾素-γ(IFN-γ)產生相關的模型[21]。因此，細胞免疫和Th1細胞因子(IFN-γ，腫瘤壞死因子α)在布魯氏桿菌感染結果中的關鍵作用得到了證實。而本研究通過ROC曲線同樣驗證了這一結果。

在KEGG富集結果中鑒定了T 細胞受體信號通路和Th17細胞分化的顯著富集。CD4+T細胞的三個亞群，Th1、Th2和Th17，是細胞內細菌免疫反應的中心參與者。IL-17A是Th17細胞產生的標志性細胞因子[22-25]。雖然Th1細胞在布魯氏桿菌病中的保護作用已被證明，但確定Th17細胞在布魯氏桿菌免疫中的確切作用正在成為一個活躍的研究領域。而我們的數據分析顯示，Th17信號通路與布魯氏桿菌病的發生發展有著密切關系。

綜上所述，為了能更好的明確布魯氏桿菌感染后宿主體內的免疫調控，為今后患者的有效診治提供可靠的理論依據。我們通過生物信息學分析了布魯氏桿菌感染對免疫的影響。鑒于宿主對布魯氏桿菌的應答主要由免疫細胞介導，因此闡明感染患者體內免疫細胞的調控機制，以及明確調控宿主體內免疫細胞的靶點，可以為將來設計針對布魯氏桿菌的藥物和疫苗提供是至關重要的理論基礎。

利益沖突：無