細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

王冰潔，趙 莉，班萬(wàn)里，段蘭利，陳云英，張壯志

囊型包蟲(chóng)病(CE)即細(xì)粒棘球蚴病，是由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)(棘球蚴)引起的一種慢性人獸共患病[1]。病變可使鄰近器官組織萎縮及功能障礙，病變包囊一旦破裂，可引起過(guò)敏反應(yīng)，甚至死亡，嚴(yán)重威脅了公共安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)，影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[2]。鑒于該病的廣泛流行和嚴(yán)重程度，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其作為17種被忽視的疾病之一納入2020年戰(zhàn)略路線(xiàn)圖[3]。在我國(guó)，幾乎所有省(直轄市、自治區(qū))都有該病的報(bào)告，尤以新疆、寧夏、青海、甘肅、陜西、西藏、四川、云南、內(nèi)蒙古等地區(qū)最為嚴(yán)重[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)每年患包蟲(chóng)病的牛、羊在5 000萬(wàn)頭(只)以上，造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)30億元，推算患病人數(shù)為166 098例[4-5]，包蟲(chóng)病仍是世界范圍內(nèi)引起家畜發(fā)病和死亡的重要原因之一。因此及時(shí)、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)囊型包蟲(chóng)病，對(duì)控制該病的流行、綜合防控措施的實(shí)施和防治效果的評(píng)價(jià)等都具有十分重要的意義。

目前，用于囊型包蟲(chóng)病的檢測(cè)方法主要有4類(lèi)，其中影像學(xué)檢測(cè)是該病檢測(cè)的首選，但難以區(qū)分病變包囊和腫瘤；病原學(xué)檢測(cè)是確診該病的經(jīng)典方法，但對(duì)實(shí)驗(yàn)人員專(zhuān)業(yè)知識(shí)和技術(shù)要求較高；免疫學(xué)檢測(cè)在早期檢測(cè)中發(fā)揮重要作用，但無(wú)法避免假陽(yáng)性結(jié)果[6-7]；分子生物學(xué)檢測(cè)是從基因水平對(duì)病原進(jìn)行檢測(cè)的方法，具有特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，目前已用于包蟲(chóng)病特異基因篩選等方面的研究[8-9]。本研究以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因的特異性引物和探針建立起了用于囊型包蟲(chóng)病檢測(cè)的熒光定量PCR方法，以便快速、準(zhǔn)確的區(qū)分Eg，并將其應(yīng)用于Eg的大規(guī)模監(jiān)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 道德申明 本研究獲得了新疆畜牧科學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)20130319-07)，所有動(dòng)物均按照中華人民共和國(guó)動(dòng)物倫理程序和指南進(jìn)行處理。

1.2 蟲(chóng)株及臨床樣本 細(xì)粒棘球蚴(cystic echinococcus)、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Eg)、多房棘球蚴(alveolar echinococcus)、多房棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusmultilocularis，Em)、腦多頭蚴(Coenuruscerebralis，Cc)、多頭多頭絳蟲(chóng)(Multicepsmulticeps，Mm)、細(xì)頸囊尾蚴(Cysticercustenuicollis，Ct)、泡狀帶絳蟲(chóng)(Taeniahydatigena，Th)及犬弓首蛔蟲(chóng)(Toxocaracanis，Tc)蟲(chóng)株均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。臨床樣本(牛/羊肝、肺包囊、犬腸道寄生蟲(chóng)體)由本實(shí)驗(yàn)室在伊犁昭蘇縣采集，樣本詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 臨床樣本信息

1.3 主要試劑 瓊脂糖、2×SuperReal PreMix(Probe)、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2×Taq PCR MasterMix、GoldenViewTM核酸染料、DL2000 Marker、pMD19-T、Taq DNA聚合酶等購(gòu)自新疆寶信生物工程有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成 針對(duì)Eg線(xiàn)粒體基因保守區(qū)，使用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針。Eg-F：5′-GCAGGTTACTTTGATATAGTAAATTGTG-3′；Eg-R：5′-CCACAATTAAAA-AAATAAATAAC-3′；Eg-P：5′-(FAM)ATACTATGGTCCATATATCTATATTAAGAGCTG-AG(TAMRA)-3′，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.4.2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 提取Eg陽(yáng)性樣本DNA并進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收純化目的片段并連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(DH5α)，篩選陽(yáng)性菌落并擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定、測(cè)序及序列分析，根據(jù)序列分析結(jié)果選擇正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定重組質(zhì)粒的濃度，并換算成拷貝數(shù)。

1.4.3 反應(yīng)體系及條件優(yōu)化 通過(guò)矩陣法篩選反應(yīng)體系中引物和探針的最適濃度組合，并確定PCR反應(yīng)的退火-延伸溫度、反應(yīng)時(shí)間及循環(huán)數(shù)。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立及敏感性試驗(yàn) 10倍梯度稀釋已知拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，得到109拷貝/μL～100拷貝/μL共10個(gè)稀釋度的質(zhì)粒模板，每個(gè)稀釋度做3個(gè)復(fù)孔，建立熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并確定該方法的最低檢出限。

1.4.5 特異性試驗(yàn) 按照建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)提取的Eg、Em、C.cerebralis、M.multiceps、C.tenuicollis、T.hydatigena及T.canis陽(yáng)性樣本DNA進(jìn)行檢測(cè)，判定該方法的特異性。

1.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 選取107～103拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，比較同一濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品在重復(fù)檢測(cè)中的擴(kuò)增曲線(xiàn)與Ct值之間有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，確定該方法的穩(wěn)定性。

1.4.7 臨床樣本的檢測(cè) 應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法、常規(guī)PCR方法和病原學(xué)方法對(duì)從伊犁昭蘇縣采集的50份疑似感染細(xì)粒棘球蚴或細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的臨床樣本(表1)進(jìn)行檢測(cè)，比較三者的敏感性和符合率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定 提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為187 bp的目的片段(圖1)，測(cè)序比對(duì)后確定為細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因，表明標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pMD19-T-Eg，質(zhì)粒濃度經(jīng)測(cè)定為100 μg/mL。

M：DNA Marker(DL2000)；1：PCR products of recombinant plasmids；2：Negative control

2.2 反應(yīng)體系及條件優(yōu)化結(jié)果 優(yōu)化后，確定最佳反應(yīng)體系為(20 μL)：2×SuperReal PreMix(Probe)10 μL，上、下游引物(10 μmoL/L)各0.5 μL，探針(10 μmoL/L)0.25 μL，模板DNA 1 μL，滅菌ddH2O 7.75 μL。最佳反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集熒光信號(hào)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及敏感性試驗(yàn)結(jié)果 以109拷貝/μL～100拷貝/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)(圖2)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖3)。從圖中可以看出建立的方法可以檢測(cè)出的標(biāo)準(zhǔn)品最低濃度為102拷貝/μL，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)R2=0.998，表明建立的方法靈敏度高、誤差小。

1～10：109 copies/μL～100 copies/μL；11：Negative control

圖3 Eg實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 以Eg、Em、C.cerebralis、M.multiceps、C.tenuicollis、T.hydatigena及T.canis陽(yáng)性樣本DNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，只有細(xì)粒棘球蚴和細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)出現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線(xiàn)(圖4)，表明建立的方法特異性較好。

1：cystic echinococcus；2：Echinococcus granulosus(107 copies/μL)；3；Eg standard plasmids；4：alveolar echinococcus；5：Echinococcus multilocularis；6：Coenurus cerebralis；7：Multiceps multiceps；8：Cysticercus tenuicollis；9；Taenia hydatigena；10：Toxocara canis；11：Negative control

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 用107拷貝/μL～103拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行的組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，變異系數(shù)均小于3%(表2)，表明建立的方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果 對(duì)采集自伊犁昭蘇縣的50份臨床樣本(表1)分別用熒光定量PCR方法、常規(guī)PCR方法和病原學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，熒光定量PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為12%(6/50)，常規(guī)PCR為8%(4/50)，病原學(xué)為12%(6/50)，三者陽(yáng)性符合率為100%。

3 討 論

我國(guó)是囊型包蟲(chóng)病的高度流行區(qū)，流行區(qū)面積達(dá)全國(guó)總面積的46%[10]。近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，動(dòng)物疫病防治工作面臨著前所未有的挑戰(zhàn)，快速、高通量檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用是開(kāi)展國(guó)家動(dòng)物疫情監(jiān)測(cè)、有效實(shí)施風(fēng)險(xiǎn)分析、加強(qiáng)動(dòng)物疫病管理和進(jìn)行市場(chǎng)監(jiān)督的重要手段。熒光定量PCR作為一種快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的自動(dòng)化檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間較普通PCR短且污染少，已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病原的主要手段之一[11]。目前熒光定量PCR方法主要包括染料法(如：SYBR Green染料)和探針?lè)?如TaqMan和MGB探針等)，雖然染料法成本比探針?lè)ǖ停结樂(lè)ㄌ禺愋院茫谂R床檢測(cè)中有著突出優(yōu)勢(shì)[12-13]。

因此，本研究基于細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)線(xiàn)粒體基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，建立了用于檢測(cè)該病的熒光定量PCR方法。該方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系好，在109～102拷貝/μL相關(guān)系數(shù)達(dá)0.998，靈敏度達(dá)102拷貝/μL，與其他病原(Em、C.cerebralis、M.multiceps、C.tenuicollis、T.hydatigena、T.canis)不存在交叉反應(yīng)，組內(nèi)和組間變異系數(shù)較小(<3%)，說(shuō)明該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性好。在臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn)中，能成功地檢測(cè)出Eg，且與普通PCR方法相比，檢出率明顯提高，檢測(cè)時(shí)間明顯縮短，說(shuō)明本研究建立的方法可以對(duì)囊型包蟲(chóng)病病原進(jìn)行檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)傳染源，對(duì)該病的防控具有重要意義。

利益沖突：無(wú)