結(jié)核分枝桿菌Hrp1蛋白的生物信息學(xué)分析

劉 靜，吳 芳，張 杰，董江濤，柳小玲，梁 粟，王 菊，張春軍，吳江東，章 樂，趙海軍，張萬江

全世界約有1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，其中大多數(shù)是潛伏性感染(Latent Tuberculosis Infection，LTBI)，目前無有效治療LTBI患者的疫苗和藥物，早發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌潛伏感染患者，并對(duì)其進(jìn)行診斷治療，可以控制后期結(jié)核病患者人數(shù)[1]。Rv2626c基因的表達(dá)是MTB處于休眠期的重要標(biāo)志之一，Rv2626c抗原受控于休眠調(diào)節(jié)子DosR(dormancy regulon)，編碼缺氧反應(yīng)蛋白1(hypoxic response protein 1, Hrp1)，Hrp1蛋白具有較好的抗原性和免疫原性，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫及較高的抗體水平，并且該蛋白易被LTBI患者所識(shí)別[2]，多項(xiàng)研究提示其很有可能會(huì)成為一種新型診斷MTB潛伏感染的候選抗原和治療潛伏性感染的候選疫苗。為此，本文對(duì)Hrp1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)研究分析，對(duì)其結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行全面分析預(yù)測，為進(jìn)一步了解MTB長期潛伏感染機(jī)制提供理論依據(jù)，以期為篩選 MTB 診斷標(biāo)志物和研制新型結(jié)核疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

通過NCBI網(wǎng)站查詢，Hrp1蛋白由143個(gè)氨基酸序列組成，檢索的氨基酸序列如下：MTTARDIMNAGVTCVGEHETLTAAAQYMREH-DIGALPICGDDDRLHGMLTDRDIVIKGLAAG-LDPNTATAGELARDSIYYVDANASIQEMLN-VMEEHQVRRVPVISEHRLVGIVTEADIARH-LPEHAIVQFVKAICSPMALAS。

1.2 方 法

1.2.1 Rv2626c基因開放閱讀框架分析及其編碼蛋白的理化性質(zhì)及親疏水性分析 分析Rv2626c基因的開放閱讀框架，采用NCBI網(wǎng)站中的ORF Finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)。上傳Rv2626c基因編碼的氨基酸序列至Protpapram生信軟件(https://web.expasy.org/protparam)及ProtScale生信軟件(http://web.expasy.org/protscale)，分析其編碼蛋白Hrp1蛋白的理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)目、分子式、分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)、親(疏)水性等。

1.2.2 Hrp1蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、糖基化及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 運(yùn)用信號(hào)肽分析系統(tǒng)SOSUI(http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/)在線軟件及Signal IP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析Hrp1的信號(hào)肽及其位置；運(yùn)用跨膜區(qū)預(yù)測軟件Tmpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED-form.ht)分析Hrp1蛋白跨膜區(qū)；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件輸入Hrp1蛋白的氨基酸序列，對(duì)該蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析[3]。利用分析Hrp1的糖基化位點(diǎn)采用NetNGlyc軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)；預(yù)測Hrp1蛋白的磷酸化位點(diǎn)采用NetPhos 3.1 Server磷酸化分析軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。

1.2.3 Hrp1蛋白的亞細(xì)胞定位分析 聯(lián)合運(yùn)用3種在線軟件：PSORT(https://www.genscript.com/psort.html)、WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)和TargetP-2.0-CBS(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對(duì)Hrp1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；預(yù)測Hrp1蛋白的核定位信號(hào)，運(yùn)用NLStradamus在線軟件(http://www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/)。

1.2.4 Hrp1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 運(yùn)用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測 Hrp1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL在線軟件(https://swissmodel.expasy.org)對(duì) Hrp1蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源性建模分析。

1.2.5 Hrp1蛋白與人類蛋白的同源性分析 采用EXPASY進(jìn)入主頁(https://web.expasy.org/blast/)，將Hrp1蛋白的氨基酸序列輸入后，點(diǎn)擊Homo sapiens，確定Run BLAST后，可對(duì)Hrp1蛋白氨基酸序列與人類蛋白的同源性進(jìn)行BLAST分析。

隨著時(shí)代發(fā)展，無人艇技術(shù)已得到深入發(fā)展。無人艇不僅可用于民用領(lǐng)域，比如海上搜救、垃圾清理和環(huán)境監(jiān)測等方面，還可用于軍事上的海上巡邏、偵查、監(jiān)視和掃雷等方面，具有十分廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。[1]同時(shí)，無人艇路徑規(guī)劃對(duì)于艦船實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化航行和航線優(yōu)化具有重要意義，要求在復(fù)雜的海洋環(huán)境中，根據(jù)已知的地理信息數(shù)據(jù)，尋找出一條從起點(diǎn)到終點(diǎn)的最安全且航程最短的航線。[2]目前已有多種算法被應(yīng)用于路徑規(guī)劃，例如粒子群算法[3]、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法[4]和人工勢場法。[5]其中遺傳算法較為靈活，使用相對(duì)廣泛，已被應(yīng)用于眾多無人設(shè)備的路徑規(guī)劃。

1.2.6 Hrp1蛋白的B細(xì)胞表位、輔助性T細(xì)胞表位、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位預(yù)測 在IEDB(http://www.iedb.org/home-v3.php)網(wǎng)站，輸入氨基酸序列，通過Karplus&Schulz分析柔韌性、Kolaskar&Tongaonkar預(yù)測抗原性、Emini預(yù)測抗原表面可及性、Parker 預(yù)測親水性及Chou&Fasman 法預(yù)測氨基酸編碼蛋白質(zhì)的β轉(zhuǎn)角，對(duì)B細(xì)胞表位進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測分析；β轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲多出現(xiàn)在蛋白表面，為凸出疏松結(jié)構(gòu)，與抗體更有利結(jié)合，成為B細(xì)胞抗原表位可能性較大[4]；最后選取親水性與表面可及性良好、柔韌性強(qiáng)、抗原性好、最好為卷曲和轉(zhuǎn)角這種可能性大的區(qū)域作為候選B細(xì)胞表位，盡量避開α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)。通過SYFPEITHI在線生信軟件(http://www.syfpeithi.de/0-Home.htm)對(duì)Hrp1抗原蛋白Th表位進(jìn)行預(yù)測[5]，進(jìn)入SYFPEITHI首頁，選擇HLA-DRB1*0101、0401、0701、0801、1101、1501這6種HLA基因分型進(jìn)行預(yù)測輔助T細(xì)胞表位，選取得分為22分以上的氨基酸序列，綜合分析后篩選出候選的輔助T細(xì)胞表位。利用RANKPEP在線生信軟件進(jìn)行預(yù)測，進(jìn)入預(yù)測界面(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)，將Hrp1氨基酸序列輸入，選擇SYFPEITHI所預(yù)測的HLA基因分型，找出在線軟件紅色標(biāo)記的結(jié)果，篩選出結(jié)果較好的多肽序列作為候選的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位。最后采用DNAStar軟件中Protean模板得到關(guān)于Hrp1蛋白表位預(yù)測的位置圖，該圖可直觀看到Hrp1蛋白表位富集的區(qū)域，具體在圖中表現(xiàn)為紅色方塊標(biāo)記的區(qū)域。

1.2.7 Hrp1蛋白的相互作用蛋白預(yù)測及富集分析 將Hrp1全長氨基酸序列上傳至STRING在線軟件(http://string-db.org/cgi/input.pl)，對(duì)Hrp1的相互作用蛋白進(jìn)行預(yù)測，其生物過程進(jìn)行功能富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 Rv2626c基因開放閱讀框架分析及其編碼蛋白的理化性質(zhì)及親疏水性分析結(jié)果

2.1.1 Rv2626c基因開放閱讀框架分析 結(jié)果顯示Rv2626c基因(ID：888576)位于MTB(H37Rv)的全基因組(NC-000962.3)的2952562-2952993區(qū)域，全長432 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG，Rv2626c基因含有5個(gè)開放閱讀框，其中最長的一個(gè)開放閱讀框顯示Rv2626c基因基本被通讀，全長432 bp，與預(yù)測的編碼Hrp1蛋白長度基本相似。

2.1.2 Rv2626c基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及親疏水性分析 根據(jù)Protpapram預(yù)測結(jié)果，該蛋白的理論等電點(diǎn)PI為4.96，分子量為15 517.72；該蛋白由143個(gè)氨基酸構(gòu)成，包含19種氨基酸，其中以丙氨酸(A)(13.3%)、異亮氨酸(I)(8.4%)、纈氨酸(V)(8.4%)3種氨基酸的組成比例較高，不包括色氨酸(W)、吡咯賴氨酸(O)和硒半胱氨酸(U)。帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)總數(shù)為21,帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數(shù)為11。Hrp1蛋白分子式為C667H1084N194O211S10，原子總數(shù)2 166，Rv2626c基因編碼蛋白的消光系數(shù)為4 595，280 nm處的吸光度為0.296。當(dāng)?shù)鞍椎腘端殘基為Met時(shí)，該蛋白在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期大于10 h。Hrp1蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)為19.62，為穩(wěn)定蛋白，脂肪族氨基酸指數(shù)為100.35，平均親水為0.042。ProtScale預(yù)測進(jìn)一步分析顯示Rv2626c基因編碼蛋白為親水性蛋白，第99位氨基酸親水性得分最高為-1.767；第132為氨基酸疏水性得分最高為1.9(圖1)。

Note：Abscissa for the amino acid position, the vertical axis for the hydrophobic score(pro，hydrophobic，respectively，with negative values，positive values)

2.2 Hrp1蛋白的信號(hào)肽、跨膜區(qū)、糖基化及磷酸化位點(diǎn)分析 運(yùn)用信號(hào)肽分析系統(tǒng)SOSUI結(jié)果顯示該蛋白為可溶性蛋白，無信號(hào)肽，該蛋白是具有一個(gè)跨膜區(qū)長度為23個(gè)氨基酸序列的跨膜螺旋，N端氨基酸位于第1位，C端位于第16位，跨膜區(qū)氨基酸序列為 MTTARDIMNAGVTCVG；Signal IP結(jié)果顯示該蛋白max.C值為0.131，max.Y值為0.117，max.S值為0.143，mean S值為0.107，其中mean S值若大于0.5，則預(yù)測為分泌蛋白，存在信號(hào)肽；故可知該蛋白沒有信號(hào)肽，不是分泌蛋白而是膜蛋白。TMpred分析Hrp1蛋白在17-33、127-143氨基酸之間可能存在跨膜結(jié)構(gòu)，無信號(hào)肽(圖2)。

圖2 Hrp1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(左)與信號(hào)肽預(yù)測(右)

TMHMM提交蛋白序列的全部氨基酸殘基共143個(gè)，結(jié)果預(yù)測分析得到該蛋白(圖3)跨膜螺旋氨基酸數(shù)為0.007 25(該指標(biāo)>18提示很有可能為跨膜蛋白)，N端前60個(gè)氨基酸中跨膜氨基酸數(shù)為0.003 25，N端位于膜胞質(zhì)側(cè)的總概率為0.469 45。綜合分析表明Hrp1蛋白位于膜外，為非跨膜蛋白。

The axis of represents the amino acid residue number(1-210)corresponding to the submitted protein sequence.The vertical axis values are the probabilities that each amino acid is inside the membrane, outside the membrane, and the helix region.

在線軟件NetNGlyc分析Hrp1的糖基化位點(diǎn)存在于84位(圖4)；采用NetPhos 3.1 Servera在線軟件預(yù)測Hrp1蛋白有6個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中磷酸化絲氨酸位點(diǎn)有2個(gè)，分別位于77、106位氨基酸；磷酸化蘇氨酸位點(diǎn)有2個(gè)，分別位于3、50位氨基酸；2個(gè)磷酸化酪氨酸位點(diǎn)，分別位于79、80位氨基酸(圖5)。

圖4 Hrp1蛋白亞基糖基化位點(diǎn)分析

圖5 Hrp1蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

2.3 Hrp1蛋白的亞細(xì)胞定位分析 PSORT結(jié)果顯示該蛋白其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)，可靠性為94.1%；在線軟件WoLF PSORT分析結(jié)果得出Cysk為12, cyto為9.5, mito為4, nucl為1.5，cyto-nucl為6，表明Hrp1蛋白可能定位于細(xì)胞質(zhì)；TargetP-2.0-CBS結(jié)果顯示該蛋白屬于分泌蛋白的可能性為0.000 1，定位在其他位置的可能性為0.999 7；NLStradamus在線軟件預(yù)測Hrp1蛋白無NLS，可推測此蛋白位于細(xì)胞核外。綜合4種在線軟件分析可得Hrp1蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)。

2.4 Hrp1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 利用在線分析軟件SOPMA預(yù)測Hrp1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋(Hh)63個(gè)，占44.06%；β-轉(zhuǎn)角(Tt)11個(gè)，占7.69%；β-折疊(Ee)30個(gè)，占20.98%；無規(guī)則卷曲(Cc)39個(gè)，占27.27%(圖6)。該蛋白結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。

Blue red green and purple stand for alpha helix extended strand beta turn and random coil respectively

利用SWISS-MODEL軟件，對(duì)Hrp1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，選擇同源性最高的1xkf.1為模板，基于Hrp1蛋白的X射線分析進(jìn)行同源三級(jí)建模(圖7)。其GMQE評(píng)分為0.91，QMEAN評(píng)分為1.47，手勢向上，說明該模型結(jié)果可靠，質(zhì)量較好。

圖7 Hrp1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

2.5 同源性分析結(jié)果 BLAST結(jié)果得出，Hrp1中氨基酸序列在第11-70位，與人類蛋白質(zhì)鋅指蛋白440(ZNF440)的96-153位氨基酸相似性較高，但二者的相似度僅為25%，因此，Hrp1與人類蛋白相比，同源性較低，交叉反應(yīng)發(fā)生的概率較低，可以作為候選的新型結(jié)核疫苗和結(jié)核病診斷靶點(diǎn)，該抗原蛋白的表位可以進(jìn)行生信分析，對(duì)結(jié)核病診斷與候選表位疫苗有一定的參考研究價(jià)值。在研究分析中，即在預(yù)測和篩選表位時(shí)，應(yīng)注意避免選擇位于11-70的氨基酸序列，以降低交叉反應(yīng)的概率[6]。

2.6 Hrp1蛋白的B細(xì)胞表位、輔助性T細(xì)胞表位、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位預(yù)測

2.6.1 Hrp1抗原蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測 通過IEDB軟件對(duì)Hrp1蛋白的B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示Hrp1蛋白的可塑性、表面可及性、線性表位、β-轉(zhuǎn)角、親疏水性、抗原6個(gè)方面(圖8)，柔韌性越強(qiáng)越有利與抗體結(jié)合，柔韌性參數(shù)以基線1.0為參照，高于1.0的氨基酸區(qū)段柔韌性強(qiáng)，是易形成抗原表位的區(qū)域，可及性高于基線1.0的區(qū)段易形成B細(xì)胞表位，再通過結(jié)合線性表位、β-轉(zhuǎn)角、抗原性這3個(gè)方面篩選，篩選得出B細(xì)胞表位(表1)。

Note: A：Linear Epitope Prediction 2.0 Results; B：Beta-Turn Prediction Result; C：Fexibility Prediction Results; D：Surface Accessibility Prediction Results; E：Hydrophlicity Prediction; F：Antigenicity Results

表1 Hrp1蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測結(jié)果

2.6.2 預(yù)測Hrp1蛋白的輔助性T細(xì)胞表位結(jié)果 使用輔助性T細(xì)胞表位分析軟件預(yù)測Hrp1蛋白的限制性Th細(xì)胞表位，對(duì)候選意義的每一種HLA 亞型相應(yīng)的表位數(shù)目情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中HLA-DRB1 * 0401、HLA-DRB1*0701表型的表位數(shù)量最多，結(jié)果如表2所示；對(duì)于某個(gè)表型預(yù)測分值較高的氨基酸序列進(jìn)行下一步分析選擇，以作為候選Th表位，如表3為最終結(jié)果。

表2 SYFPEITHI軟件預(yù)測的Hrp1蛋白Th細(xì)胞表位信息

表3 Hrp1蛋白Th細(xì)胞表位綜合分析

2.6.3 Hrp1蛋白的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞預(yù)測分析結(jié)果 根據(jù)預(yù)測軟件結(jié)果，選擇出每一種表型分值較高的多肽序列，其可成為候選CTL表位，具體結(jié)果見表4。

表4 Hrp1蛋白CTL表位綜合分析

結(jié)合Hrp1蛋白的B細(xì)胞表位、輔助性T細(xì)胞表位、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果，根據(jù)DNAStar軟件中Protean模板得到關(guān)于Hrp1蛋白表位預(yù)測的位置圖，該圖可直觀看到Hrp1蛋白表位富集的區(qū)域，具體的表位富集表現(xiàn)在紅色方塊標(biāo)記的區(qū)域(圖9)。

圖9 Hrp1蛋白表位預(yù)測位置圖

2.7 Hrp1蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果 STRING在線分析軟件預(yù)測了與Hrp1蛋白相互作用的蛋白有Rv2627c、Rv2628、Rv1738、devR、Rv2624c、TB31.7、rip3、pfkB、guaA、hspX(圖10)。通過分析Hrp1的相互作用蛋白，可得Hrp1可能在活化的巨噬細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量 NO，然后作為細(xì)胞間的信號(hào)分子殺傷被吞噬的微生物，調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞一系列重要的功能；該蛋白可能與抑制蛋白質(zhì)合成有關(guān)，刺激巨噬細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌重要的細(xì)胞因子，然后減少細(xì)菌生長，該蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)主要涉及NF-kB信號(hào)通路。

圖10 MTB H37Rv Hrp1相互作用蛋白

3 討 論

目前在臨床上唯一預(yù)防結(jié)核病的疫苗是卡介苗(BCG)，但卡介苗基因組發(fā)生的眾多突變導(dǎo)致相當(dāng)一部分人群喪失保護(hù)效力，其對(duì)不同人群的保護(hù)效率差異較大，機(jī)體保護(hù)水平范圍從0%～80%不等，且對(duì)潛伏感染MTB沒有保護(hù)效果[7]。在臨床上約有90%的結(jié)核桿菌感染者，其身體基本上處于健康狀態(tài)，但是如果機(jī)體免疫系統(tǒng)缺乏抵抗力，結(jié)核桿菌會(huì)重新復(fù)制，病灶被打破，隨之大量的細(xì)菌釋放，首先進(jìn)入肺部，隨后至全身，發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核，故結(jié)核病疫情控制工作者一直關(guān)注結(jié)核潛伏期感染診斷試劑和治療性疫苗的研究開發(fā)。結(jié)核桿菌可以在細(xì)胞內(nèi)潛伏數(shù)十年，因此需要一個(gè)可以誘導(dǎo)具有長期記憶的綜合免疫保護(hù)應(yīng)答疫苗，在持續(xù)感染人群中,檢測到對(duì)持續(xù)感染期抗原的具有一定的特異性反應(yīng)，而沒有在卡介苗免疫人群檢測到，因此猜想以潛伏感染相關(guān)蛋白設(shè)計(jì)相關(guān)疫苗，有希望研究出針對(duì)持續(xù)感染期抗原的保護(hù)性免疫反應(yīng)，這有助于在潛伏感染期間清除MTB的復(fù)發(fā)。對(duì)結(jié)核分枝桿菌相關(guān)潛伏感染蛋白以生信軟件為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能的生物信息學(xué)分析，可為結(jié)核病潛伏感染致病機(jī)制的闡述及新型藥物結(jié)核疫苗的開發(fā)提供一定的研究理論基礎(chǔ)，而關(guān)于抗原表位的研究也成為最近MTB診斷預(yù)防治療的重點(diǎn)方向。在本文研究中，聯(lián)合運(yùn)用生物信息學(xué)的技術(shù)方法對(duì)Hrp1蛋白的相關(guān)信息進(jìn)行分析、處理、模擬和預(yù)測，本文預(yù)測抗原表位的模式，可提高該蛋白用于表位疫苗的研發(fā)及診斷和實(shí)驗(yàn)試劑開發(fā)的水平，避免耗費(fèi)大量的人力和物力，對(duì)免疫學(xué)的發(fā)展非常有益，使免疫學(xué)數(shù)據(jù)更加豐富。

缺氧反應(yīng)蛋白1是由Rv2626c基因編碼，Bashir等在研究中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)鼠的巨噬細(xì)胞表面結(jié)合重組Hrp1蛋白后可以引起小鼠體內(nèi)發(fā)生Ⅰ型免疫反應(yīng)，并且小鼠體內(nèi)的NO及iNOS分泌量增加，小鼠巨噬細(xì)胞B7-1、B7-2和CD40的表達(dá)隨之增強(qiáng)，經(jīng)重組Hrp1蛋白刺激后的小鼠巨噬細(xì)胞和活動(dòng)性結(jié)核病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞可分泌高水平的IL-12及TNF-α[8]。Azzurri等應(yīng)用ELISA方法對(duì)結(jié)核病患者血清中抗Hrp1抗體水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的活動(dòng)性結(jié)核病患者高于結(jié)核病密切接觸者及健康社區(qū)對(duì)照人群，結(jié)核病患者化療后抗Hrp1抗體水平下降[9]。Roupie等將Hrp1 DNA疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠IFN-γ和IL-2分泌增加，Hrp1 DNA疫苗可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)及Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)的效力優(yōu)于其他潛伏感染抗原Rv1733c、Rv1738、Rv2029c、Rv2031c、Rv2023、Rv2627c及Rv2628[10]。由此可知Hrp1具有較好的免疫原性，其通過固有免疫及獲得性免疫兩種方式來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的效應(yīng)能力，且該抗原蛋白很容易被結(jié)核分枝桿菌潛伏患者所識(shí)別，多項(xiàng)研究提示其很有可能會(huì)成為一種新型診斷MTB潛伏感染的候選抗原和潛伏性感染的候選疫苗。

本研究利用多種工具和生物信息學(xué)資源對(duì)結(jié)核分枝桿菌Hrp1蛋白的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能等進(jìn)行分析。結(jié)核分枝桿菌Hrp1由143個(gè)氨基酸組成，該蛋白分子式為C667 H 1084 N194 O211 S10，理論等電點(diǎn)PI為4.96，分子量為15 517.72，不穩(wěn)定性指數(shù)為19.62，為穩(wěn)定疏水性蛋白。ORF Finder發(fā)現(xiàn)Rv2626c基因全長432 bp，含有5個(gè)開放閱讀框，其中最長的一個(gè)開放閱讀框顯示Rv2626c基因基本被通讀，全長432 bp，與預(yù)測的編碼Hrp1蛋白長度基本相似。綜合利用Protpapram、ProtScale、SOSUI工具預(yù)測Hrp1蛋白無信號(hào)肽，并通過在線生信軟件可知該蛋白不屬于分泌蛋白，主要定位在結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮功能[11]。其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲，共占71.33%，生物信息學(xué)分析Hrp1蛋白含有6個(gè)磷酸化位點(diǎn)，具有良好的抗原優(yōu)勢表位和氨基酸磷酸化位點(diǎn)，推斷猜想以該蛋白設(shè)計(jì)疫苗，有助于在潛伏感染期間清除MTB的復(fù)發(fā)，是探索結(jié)核分枝桿菌持久性感染機(jī)制的重要研究靶標(biāo)。該蛋白無規(guī)則卷曲占27.27%，表明其容易與抗體嵌合，并預(yù)測Hrp1含有多個(gè)T細(xì)胞的抗原優(yōu)勢表位。蛋白抗原的二級(jí)結(jié)構(gòu)與B細(xì)胞表位關(guān)系密切[12]，對(duì)Hrp1二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、表面可能性、柔韌性和抗原性等進(jìn)行全面分析，最后結(jié)果可知12-18、34-40、76-85、99-114位等4個(gè)B細(xì)胞表位。目前預(yù)測輔助性T細(xì)胞表位效果較好且常用的在線生信軟件是SYFPEITHI，本研究篩選中國人群常見的MHC-Ⅱ類分子亞型DRB1* 0101、0401、0701、0801、1101、1501[13]，綜合分析得到的結(jié)果對(duì)于研究中國人群具有一定的實(shí)際意義。經(jīng)過結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，本研究對(duì)Hrp1抗原蛋白的Th 細(xì)胞、CTL 和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測分析，并應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測分析Hrp1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)現(xiàn)Hrp1蛋白含有較豐富的B、T細(xì)胞抗原表位，為進(jìn)一步研究該蛋白的功能和明確其在MTB潛伏感染機(jī)制中作用提供理論依據(jù)，以期為篩選 MTB 診斷標(biāo)志物和研制新型表位結(jié)核疫苗奠定基礎(chǔ)[14]。STRING數(shù)據(jù)庫分析顯示Hrp1蛋白與Rv2627c、Rv2628、Rv1738、devR、Rv2624c、TB31.7、rip3、pfkB、guaA和hspX有相互作用，該蛋白可能刺激產(chǎn)生NO及細(xì)胞因子的過程受轉(zhuǎn)錄因子NF-kB調(diào)控，NO可通過MTB的休眠調(diào)節(jié)子啟動(dòng)Rv2626c基因在內(nèi)的多個(gè)下游基因的表達(dá)，使MTB進(jìn)入休眠狀態(tài)，抵御宿主免疫系統(tǒng)的殺傷。與抑制蛋白質(zhì)合成有關(guān)，還可能會(huì)刺激巨噬細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌重要的細(xì)胞因子[15]。

目前對(duì)MTB缺氧相關(guān)潛伏期抗原蛋白Hrp1的機(jī)制尚不十分清晰明確[16]，深入研究Hrp1的免疫學(xué)特性及結(jié)構(gòu)功能特征，對(duì)控制結(jié)核潛伏感染、預(yù)防結(jié)核發(fā)病和結(jié)核免疫治療具有一定意義。本研究對(duì) Hrp1蛋白進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析，采用多種方式在多個(gè)角度進(jìn)行了分析和預(yù)測，有效地規(guī)避了單一軟件預(yù)測的缺陷，為進(jìn)一步研究Hrp1蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、理化性質(zhì)提供參考，為進(jìn)一步揭示結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

利益沖突：無