注射用丹參多酚酸對大面積腦梗死患者血管新生促進作用及對腦灌注改善作用的觀察研究

張 娟， 趙路清， 胡風云， 喬美玲， 馬 慧

目前，注射用丹參多酚酸被廣泛用于缺血性心血管疾病和腦血管疾病的治療。研究表明，注射用丹參多酚酸可通過促進血管新生提高體外皮瓣移植的成功率[1]，且血清中血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管生成素(Angiopoietin，Ang)也可促進血管新生[2～4]。并且，研究表明準連續式動脈自旋標記成像(pseudo-continuous arterial spin labeling，pCASL)對微血管的觀察敏感[5]，且不易受其他血流的影響[6]，可更好地通過CBF定量反映腦組織灌注情況，進一步評估血管新生。據此，本研究通過比較大面積腦梗死患者治療前、治療后14 d血清中VEGF、bFGF、Ang的變化及pCASL磁共振成像病變腦組織感興趣區(region of interest，ROI)腦血流量(cerebral blood flow，CBF)與對側鏡像區CBF的比值(CBF病變/CBF正常)的變化、NIHSS評分及mRS評分的變化來評估注射用丹參多酚酸對大面積腦梗死患者血管新生相關因子的調節作用，及對腦組織灌注及神經功能的改善作用。

1 對象和方法

1.1 病例選取 選取2018年5月至2019年5月于山西省人民醫院住院經頭部核磁確診的大面積腦梗死(large area cerebral infarction)患者，共44例，入選標準均符合全國腦血管病學術會議修訂的診斷標準及評定方法。

入組標準：年齡40～75歲；發病72 h以內的大面積腦梗死患者；首次腦血管病發病者，或曾有腦血管病病史，但未留后遺癥，且不影響本次NIHSS評分，卒中發病前mRS評分≤1分；經頭部核磁DWI檢查示頸內動脈系統大面積腦梗死；在知情同意情況下能夠接受和配合抽血檢驗、核磁檢查。樣本含量為44例。

排除標準：既往有神經系統疾病病史；既往存在較嚴重的高血壓、糖尿病、結締組織疾病病史，血管檢查提示存在明顯的動脈粥樣硬化表現，尤其是已存在嚴重大動脈狹窄；合并嚴重肝腎功能異常；近期手術史；治療過程中轉入神經外科行手術治療；存在磁共振檢查禁忌證；對丹參多酚酸過敏；死亡患者。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 兩組患者均給予脫水降顱壓、腦保護治療，丹參多酚酸治療組在以上用藥基礎上加用注射用丹參多酚酸(天津天士力之驕藥業有限公司生產，淺棕色凍干粉針，規格：每支含丹參多酚酸130 mg，批準文號為國藥準字Z20110011，有效期為24 m)滴注，一日一次，一次1支(130 mg)，兩組療程均為14 d。

1.2.2 血清觀察指標實驗步驟及NIHSS、mRS評分 兩組患者分別于治療前、后均采集標本靜脈血5 ml，將標本置于離心儀上，設置參數為3000 r/min，10 min后取上清液，將標本標號后置于-80 ℃超低溫冰箱(海爾公司)保存；從密封袋中取出實驗所需板條平衡至室溫，未使用的板條和干燥劑放入鋁箔袋內，密封口袋置于4 ℃；設置標準品孔和樣本孔后依次排序，分別于標準品孔中加入不同濃度的標準品50 μl，于樣本孔中按標記好的標本序號先加入標本10 ml，后加入樣本稀釋液40 μl，空白孔不加；除空白孔外，標準品孔和樣本孔每孔中依次加入過氧化物酶標記的檢測抗體100 μl，將反應孔封住，置于恒溫箱孵育60 min；棄去反應孔內液體，吸水紙拍干，每孔加入洗滌液350 μl，靜置1 min后棄去洗滌液，于自動洗板機上重復上述過程5次；每孔分別加入底物A、底物B各50 μl，置于恒溫孵育箱15 min；每孔加入終止液50 μl，即刻將板條置于酶標儀上測量OD450值(3 min內)，在儀器保存讀數結果并打印一份紙質結果即獲得血清VEGF、bFGF、Ang因子水平。

分別于治療前、治療后14 d進行NIHSS評分、mRS評分。

1.2.3 pCASL掃描及數據 采集使用八通道掃描線圈的德國西門子超導型3.0T磁共振成像系統進行射頻發射。常規分別于發病72 h內的大面積腦梗死患者行T1加權像(T1-weighted imaging，T1WI)、液體衰減反轉恢復序列(fluid attenuated inversion recovery，FLAIR)、彌散加權像(diffusion weighted imaging，DWI)序列掃描，于治療前、治療后14 d行pCASL檢查，采用pCASL的標簽后延遲(Post labeling delay，PLD)時間為2525 ms，取治療前、治療后14 d取同一層面的同一位置，且病變腦組織明顯低灌注區域為ROI區，分別于病變腦組織及其鏡像區域多次測量此區域不同部位CBF值，然后取其平均值即為CBF值。pCASL掃描所得的圖像和數據均由山西省人民醫院具有多年閱片和數據處理的醫師完成。典型大面積腦梗死患者治療前、治療后14 d腦組織在pCASL圖像上的表現見圖1。

圖1 大面積腦梗死患者治療前、治療后14 d腦組織pCASL圖像

1.2.4 臨床療效評定指標

1.2.4.1 神經功能缺損程度 采用美國國立衛生院腦卒中量表(National Institutes Healthy Stroke Scales，NIHSS)進行評定，滿分30分，分值越高，神經功能缺損癥狀越嚴重。

1.2.4.2 殘疾狀況 采用改良Rankin量表(modified Rankin Scales，mRS)進行評定，患者評分0～2分判定為獨立，3～5分判定為殘疾。評分均由山西省人民醫院神經內科具有檢查資質的人員進行，且保證檢查人員的固定、檢查場所的安靜、私密。

1.2.5 藥物毒性作用觀察指標 觀察兩組患者在治療前、后及治療過程中肝腎功能、凝血功能、血細胞分析及有無皮疹等過敏反應及其他不良事件。以上血液觀察指標均由山西省人民檢驗科應用統一儀器檢驗。

2 結 果

按照入組標準共入選44例大面積腦梗死患者，其中3例因病情變化變化轉入神經外科手術治療，1例因死亡脫離，最終參與結果分析患者為丹參多酚酸治療組和對照組各20例，共40例。

2.1 基線資料比較 將兩組患者年齡、性別及高血壓、糖尿病患病率進行比較，差異無統計學意義(P>0.05)；比較兩組患者治療前血清Ang、bFGF、VEGF水平，無統計學差異(P>0.05)；兩組患者治療前CBF病變/CBF正常水平，無統計學差異(P>0.05)；兩組患者治療前NIHSS評分、mRS評分比較，無統計學差異(P>0.05)(見表 1)。

表1 兩組患者基線資料比較

2.2 兩組患者治療前、后血清Ang、bFGF、VEGF水平的比較 兩組患者治療前、治療后14 d血清Ang、bFGF、VEGF水平比較，丹參多酚酸治療組有統計學差異(P<0.05)，對照組血清VEGF有統計學差異(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組患者治療前、后血清Ang、bFGF、VEGF水平差值的比較(pg/ml)

2.3 兩組患者治療后14 d血清Ang、bFGF、VEGF水平的比較 兩組患者治療后14 d血清Ang、bFGF、VEGF水平比較，有統計學差異(P<0.05)，丹參多酚酸治療組Ang、bFGF、VEGF水平較對照組明顯升高(P<0.05)(見表3)。

表3 兩組患者治療后14 d血清Ang、bFGF、VEGF水平的比較(pg/ml)

2.4 兩組患者治療前、后CBF病變/CBF正常水平的比較 兩組患者治療前、后14 d CBF病變/CBF正常水平比較，有統計學差異(P<0.05)(見表4)。

表4 兩組患者治療前、后CBF病變/CBF正常水平差值的比較

2.5 兩組患者治療后14 d CBF病變/CBF正常水平、NIHSS、mRS評分的比較 兩組患者治療后14 d CBF病變/CBF正常水平、NIHSS、mRS評分比較，有統計學差異(P<0.05)，丹參多酚酸治療組CBF病變/CBF正常水平較對照組明顯升高(P<0.05)，丹參多酚酸治療組NIHSS、mRS評分較對照組下降明顯(P<0.05)(見表5)。

表5 兩組患者治療后14 d CBF病變/CBF正常水平的比較

2.6 不良反應 兩組患者治療前后及治療過程中均未見明顯藥物相關性肝腎功能損害，未見明顯藥物相關性凝血功能及血常規異常，且無明顯皮疹出現。

3 討 論

腦梗死的側支循環分為三級，在缺血早期即可形成且發揮代償作用的為一級側支循環即腦底的Willis環，二級側支循環為眼動脈、軟腦膜吻合支以及其他顱內外動脈分支的吻合，三級側支循環形成時間最長，為新生血管的形成，是最終的側支代償途徑。而新生血管較難以用肉眼及常規檢查項目直接觀察，因此，如何能夠更好的觀察新生血管的情況顯得尤為重要。

近年來，新生血管的形成及成熟程度已成為治療的重要目標，并且會直接影響組織的灌注及代謝。研究表明，Ang、bFGF、VEGF均可促進血管新生[2～4]。

Ang-Tie系統是近期發現的維持血管內皮細胞穩態的一個特定系統，對正常血管發育以及血管生成至關重要[7]。其中，Ang 是一個分泌糖蛋白配體家族，主要作用于血管，以控制血管發育和穩定[8]，其包括C端的FReD(fibrinogen-related domain)和N-terminus的超級聚類區域(superclustering region)[9]，通過C端FReD 中的P 域與Tie受體結合[ 10]。炎癥和缺氧刺激均可增加Ang-2表達，也可促進血管內皮活化、降低血管穩定性，以促進新血管生成和重塑[11]。相反，Ang-1主要在血管生成后，可通過抑制組織纖維化促進血管穩定性、調解血管正常化[12]。因此，Ang-Tie系統可以促進血管新生。

bFGF是一種血管生長因子和活性肽，通過將囊泡釋放到細胞間空間進行信號轉導，促進血管生成自體效應[13]。bFGF可通過與成纖維因子受體(fibroblast growth factor receptor，FGFR)的相互作用，介導FGFR二聚化、磷酸化和信號通路的激活，如Ras-MAPK和PIK-3通路，進而激活FGF/FGFR軸從而增加血管生成潛力促進血管新生[14]，也可以通過促進血管再生、血管網的建立，進而促進缺血半暗帶的血管再生，改善腦梗死區血液供應，改善腦梗死患者的治療效果和預后[3]。并且，Tanaka等也提出bFGF可以提供缺血半暗帶的血流量進而提高治療效果[15]。

VEGF作為內皮細胞增殖、入侵和遷移的繁殖因子和刺激因素促進血管新生[4]。VEGF通過激活PI3K-Akt通路和對抗凋亡蛋白如Bcl-2的調節來增強內皮細胞存活率[16]，還可通過激活Erk1/2信號和內皮細胞遷移、激活焦點粘附激酶(FAK)以及誘導若干細胞外基質降解蛋白，包括金屬蛋白酶、尿激酶型質原活原活化劑(uPA)和組織型質原活化劑(TTPA)調節內皮細胞的增殖促進血管新生[17]。

本研究顯示，排除年齡、性別、高血壓、糖尿病因素對血清Ang、bFGF、VEGF的影響，丹參多酚酸治療組和對照組均可使血清Ang、bFGF、VEGF水平升高(P<0.05)，且丹參多酚酸治療組較對照組患者血清Ang、bFGF、VEGF水平升高更顯著。導致這一結果的原因可能為在缺血缺氧狀態下，注射用丹參多酚酸通過C端的FReD中的P域與Tie受體結合進而對Ang-Tie系統中的Ang-1、Ang-2產生調節作用，且缺氧刺激增加Ang-2表達，其可促進血管內皮活化、降低血管穩定性，進而促進新血管生成和重塑[6]，同時可通過誘導平滑肌細胞和內皮細胞以及與血清VEGF相互作用使血清中Ang升高；通過將釋放囊泡至細胞空間激活信號通路進而發揮作用使血清中bFGF升高，bFGF可通過與成纖維因子受體(fibroblast growth factor receptor，FGFR)的相互作用，進而激活FGF/FGFR軸從而增加血管生成潛力促進血管新生[14]；VEGF可通過作用于PI3K-Akt通路、激活Erk1/2信號通路、激活焦點粘附激酶(FAK)以及誘導若干細胞外基質降解蛋白等多種方式刺激內皮細胞的增殖，VEGF進一步作為內皮細胞的繁殖因子和刺激因素促進血管新生[16]。并且研究表明，注射用丹參多酚酸的主要成分丹酚酸B也作用于STAT3/VEGF信號通路調節信號傳感器和活化劑轉錄3(STAT3)磷酸化蛋白表達促進VEGF升高[18]。

CBF是體現大腦功能和新陳代謝的一個生理參數[19]，也是研究腦組織處于正常或疾病狀態的一個基本參數[20]。因此，CBF被廣泛用于評估腦組織的功能，尤其是被用于評估腦疾病治療的有效性[21]。目前有各種CBF定量測量方法，Detre等[22]于1992年首次報告了一種非侵入核磁灌注技術即動脈自旋標簽(arterial spin labeling，ASL)，它是一種以動脈水作為內源性示蹤劑，可以生成CBF的絕對測量值及CBF的腦血流量地形圖，而且適合跟蹤由于恢復或治療干預而隨時間變化而變化的多項研究[23]。其中pCASL是一種可以對特定時刻腦血流量CBF進行體內準確測量，且可以通過設置多個PLD來測量多個時刻灌注水平的一種核磁技術[24]，因此本研究采用測量pCASL的CBF值來評估腦組織的灌注情況。

目前研究表明，pCASL對微血管狀態敏感[5]，可更好的觀察側支循環，且對于腦疾病臨床癥狀出現之前和腦組織灌注發生異常的最初階段也同樣敏感[25]。pCASL通過監測腦血流量已被應用于腦血管疾病、腦腫瘤的分級、阿爾茨海默病(AD)、癲癇、帕金森疾病嚴重程度的分級等[26～28]。CBF降低，可作為神經元退化的早期標志[29]，通過使b-淀粉樣蛋白升高和毛細血管低灌注[30]，導致神經元功能障礙。本研究顯示，通過pCASL檢測的丹參多酚酸治療組ROI區CBF病變/CBF正常值升高較對照組顯著，可能與注射用丹參多酚酸促進側支循環形成有關。

本研究顯示，丹參多酚酸治療組與對照組均可使NIHSS評分、mRS評分較治療前下降(P<0.05)，且丹參多酚酸治療組較對照組下降顯著。導致這一結果的原因可能不僅與注射用丹參多酚酸可促進血管新生形成三級側支循環，改善腦灌注相關，而且還與其神經元保護、清楚自由基、抗氧化等作用有關。總之，注射用丹參多酚酸可通過改善腦組織灌注、保護神經元、清楚自由基等作用改善神經功能。

綜上所述，注射用丹參多酚酸對大面積腦梗死患者血清血管新生相關因子具有一定的調節作用，進而通過血管新生改善腦組織灌注，進一步改善患者神經功能缺損癥狀，且研究表明注射用丹參多酚酸具有保護神經元、抗氧化、抗炎、穩定線粒體內膜等多種功能，可通過拯救缺血半暗帶、挽救神經元及神經細胞，改善大面積腦梗死患者預后。本研究提示我們，可通過早期監測患者血清中血管新生相關因子的濃度，聯合pCASL監測腦組織灌注情況，從而間接評估側支循環情況，進一步評估大面積腦梗死患者的預后。