雄性APP/PS1/Tau 三轉(zhuǎn)基因小鼠阿爾茨海默病樣病理的年齡相關(guān)性變化

劉 碩， 朱 昆， 王國慶， 張瀟怡， 杜 娟， 曹云鵬

阿爾茨海默病(AD)是癡呆中最典型的疾病，占所有癡呆病例的50%至60%[1]。AD的典型病理標志是神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)和細胞外的淀粉樣斑塊(SP)沉積[2]，此外還包括神經(jīng)突觸營養(yǎng)不良、星形膠質(zhì)細胞增生、小膠質(zhì)細胞活化以成熟神經(jīng)元標記物改變等[3]。目前，越來越多種類的轉(zhuǎn)基因鼠模型在AD的研究中做出貢獻[4，5]，其中APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠(3xTg-AD)是最常用的AD轉(zhuǎn)基因模型之一。3xTg-AD小鼠同時表達3種罕見的家族突變基因：人PS1M146V、人APPswe和人tauP301L，在評估共同進化的淀粉樣蛋白和tau病理學(xué)方面具有重要參考價值[6]。本實驗主要探究2～15月齡雄性3xTg-AD小鼠每兩個月腦組織AD相關(guān)性病理形態(tài)學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 我們采用3xTg-AD小鼠共21只，C5B7L/6J(野生型，WT) 共 21只，均為雄性，體重25～30 g，SPF級；3xTg-AD小鼠及C57BL/6J小鼠均由美國Jackson Laboratory公司提供。該實驗經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準同意。

1.2 藥物與主要試劑 封閉用山羊血清(Solarbio，SL038)、鼠SP法染色試劑盒(中杉金橋)、兔SP法染色試劑盒(中杉金橋)、DAB濃縮型試劑盒20X(Solarbio，DA1010)、Quick Block組化一抗稀釋液(Beyotime，P0262)、一抗：6E10(BioLegend)、Tau Monoclonal Antibody(HT7，Invitrogen)、Phospho-Tau Monoclonal Antibody(AT8，Invitrogen)、GFAP(Abcam)、NEUN(Abcam)，蔗糖(滬試)、乙二醇(恒興試劑)二水合磷酸二氫鈉(滬試)、十二水合磷酸氫二鈉(滬試)、檸檬酸鈉(Solarbio)、蘇木素(Solarbio)、酸性乙醇分化液(Solarbio)、免疫組化筆(邁新試劑)。

1.3 儀器 平推切片機(Leica)；正置倒置一體熒光顯微鏡(Echo Revolve)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 雄性3xTg-AD三轉(zhuǎn)基因小鼠按2、4、6、8、10、12、15月齡分為7組，每組各3只，作為實驗組；雄性C5B7L/6J小鼠(Wild Type，WT)按2、4、6、8、10、12、15月齡分為7組，每組各3只，作為對照組。

1.4.2 心臟灌流法獲取腦組織 按體重計算小鼠所需麻醉劑量；將小鼠固定于手術(shù)臺，用鑷子提起劍突處的皮膚，外科手術(shù)剪剪開皮膚及肋骨，暴露心臟及肝臟，分離小鼠心臟周圍系膜，剪開鼠右心耳，使血液流出，同時將抽取10 ml生理鹽水的注射器插入小鼠左心室，灌注生理鹽水，待肝臟顯白色后停止灌注；剪斷小鼠頸部，從頸部向前沿中線剪開小鼠頭部皮膚，于小鼠嗅球處剪斷顱骨，暴露大腦完整形態(tài)，沿大腦正中裂剪開顱骨，用鑷子將雙側(cè)顱骨分離，暴露大腦及小腦，從小腦底部向前分離腦組織，將大腦及小腦至于含有生理鹽水的表面皿中，用刀片切割小腦及左右大腦半球，分裝于2 ml離心管中備用。

1.4.3 沉糖 自來水沖洗4%多聚甲醛固定的腦組織 24～72 h；沖洗后腦組織放入30%蔗糖溶液中，待其沉入管底。

1.4.4 切片 使用Leica平推切片機，切片厚度為20 μm，到達海馬后每1 mm裝入同一凍存管，4 ℃保存。

7.建立甘浚鎮(zhèn)留守兒童網(wǎng)站。構(gòu)建起留守兒童網(wǎng)站的目的就是為孩子們解決實質(zhì)性的問題，開展各種各樣的服務(wù)，如思想教育和生活服務(wù)等，讓孩子們可以在家或者是中心里感受到家庭的溫暖，安心地學(xué)習(xí)和生活，即便是父母外出務(wù)工，也可以安心在外，有助于推動社會的穩(wěn)定發(fā)展。

1.4.5 撈片 取出凍存管中的組織切片，磷酸緩沖液(0.01 mol/L)沖洗3次，每次1 min；取出組織切片完整且不重疊地吸附在載玻片上，室溫風(fēng)干3 h以上。

1.4.6 抗原修復(fù) 將吸附有組織切片的載玻片放入大約60 ℃的檸檬酸鈉(pH=6.0)抗原修復(fù)液中，微波爐加熱修復(fù)，自然冷卻至室溫，吸水紙正反面擦干玻片，免疫組化筆沿切片邊緣畫圈。

1.4.7 免疫反應(yīng) 磷酸緩沖液(0.01 mol/L) 沖洗3次，每次1 min；滅活內(nèi)源性過氧化酶(3%過氧化氫)孵育15 min；磷酸緩沖液(0.01 mol/L)沖洗3次，每次1 min；10%山羊血清封閉30 min；加入6E10、HT7、AT8、GFAP、NEUN一抗(稀釋比例按說明書)，4 ℃過夜；磷酸緩沖液(0.01 mol/L)沖洗3次，每次1 min；加入二抗，室溫反應(yīng)2 h；磷酸緩沖液(0.01 mol/L)沖洗3次，每次1 min；加入生物素-鏈霉卵白素試劑，室溫反應(yīng)30 min；磷酸緩沖液(0.01 mol/L)沖洗3次，每次1 min。

1.4.8 染色 滴加DAB顯色液室溫避光反應(yīng)15 min；磷酸緩沖液(0.01 mol/L)沖洗3次，每次1 min；滴加蘇木素染液，室溫反應(yīng)1 min，放入自來水中中止反應(yīng)；酸性乙醇分化液分化2～5 s，水洗；返藍1～2 s，水洗。

1.4.9 脫水 70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ分別脫水2、2、4、4、4、4 min。

1.4.10 封片 將中性樹膠滴于組織上，蓋玻片蓋于封片劑頂端，通風(fēng)櫥內(nèi)持續(xù)通風(fēng)24～48 h。

1.4.11 觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

A：3xTg-AD小鼠與WT小鼠海馬2～15 m齡(m)CA1區(qū)Aβ(6E10)免疫染色。B：3xTg-AD小鼠與WT小鼠2～15 m齡(m)感覺皮質(zhì)區(qū)Aβ(6E10)免疫染色。比例尺=120 μm

A：3xTg-AD小鼠與WT小鼠海馬CA1區(qū)2～15 m齡(m)tau 蛋白 AT8(Ser202/Thr205)免疫染色。B：3xTg-AD小鼠與WT小鼠感覺皮質(zhì)區(qū)2～15 m齡(m)tau 蛋白 AT8(Ser202/Thr205)免疫染色。比例尺=120 μm

A：3xTg-AD小鼠與WT小鼠海馬CA1區(qū)2～15 m齡(m)GFAP免疫染色，B：3xTg-AD小鼠與WT小鼠感覺皮質(zhì)2～15 m齡(m)GFAP免疫染色。比例尺=150 μm

A：3xTg小鼠與WT小鼠海馬CA1區(qū)2～15月齡(m)Neun免疫染色，B：3xTg小鼠與WT小鼠海馬CA3區(qū)2～15月齡(m)Neun免疫染色。比例尺=100 μm

3 討 論

3xTg-AD小鼠是一種信息豐富的臨床前模型，越來越多地用于檢查AD潛在的機制。本研究目的在于用免疫組化方法檢測2～15月齡雄性3xTg-AD小鼠海馬和感覺皮質(zhì)中，淀粉樣蛋白沉積，致病性Tau磷酸化、星形膠質(zhì)增生以及成熟神經(jīng)元標記物的演變。

抗淀粉樣蛋白抗體一直是AD等神經(jīng)退行性疾病研究的重點，它們是重要的研究工具和潛在的治療劑。盡管已經(jīng)開發(fā)了針對淀粉樣蛋白Aβ的100多種不同的單克隆抗體，但兩種最常用的單克隆抗體是6E10和4G8，其中6E10對人Aβ具有特異性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，2～15月齡雄性3xTg-AD小鼠，沒有明顯的淀粉樣斑塊沉積，可能主要是由于性別因素的影響。CA1區(qū)6E10陽性神經(jīng)元染色強度2～8月齡穩(wěn)定，8月齡后開始逐漸增強；但在感覺皮質(zhì)區(qū)染色強度沒有顯著差異。

Tau是一種磷蛋白，正常低水平的磷酸化才能使Tau發(fā)揮最佳功能，而高水平異常磷酸化的Tau則失去其生物學(xué)活性[8]。異常磷酸化的Tau逐漸導(dǎo)致軸突運輸功能喪失而直接或間接地在AD的發(fā)病機制中起著中心作用。影響AD最主要的十個超磷酸化位點是Ser198，Ser199，Ser202，Thr231，Ser235，Ser396，Ser404，Ser409，Ser413和Ser422[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，雄性3xTg-AD小鼠海馬CA1區(qū)2、4、6月齡之間AT8 磷酸化程度沒有顯著差異，6月齡后AT8磷酸化程度開始升高；感覺皮質(zhì)區(qū)2、4、6、8、10月齡之間磷酸化程度沒有顯著差異，12月齡后磷酸化程度開始升高。

人類tau P301L突變是3xTg-AD小鼠中攜帶的轉(zhuǎn)基因之一，常用于研究人類Tau蛋白病(如進行性核上性麻痹，皮質(zhì)基底變性，額顳癡呆等)的小鼠模型中[10]。使用單克隆抗體HT7可以檢測到人tau P301L突變體的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)，雄性3xTg-AD小鼠從2個月齡開始，就可以在海馬CA1中檢測到人tau P301L轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，但在感覺皮質(zhì)中數(shù)量非常有限。海馬CA1區(qū)2～6月齡HT7染色程度降低，6～15月齡染色程度保持穩(wěn)定；感覺皮質(zhì)區(qū)2～4月齡HT7染色程度增加，4～15月齡染色程度保持穩(wěn)定。人Tau蛋白表觀水平的此類變化可能是由于Tau磷酸化狀態(tài)的年齡相關(guān)性，從而導(dǎo)致HT7表位的位阻和/或結(jié)構(gòu)改變。

近十幾年，神經(jīng)炎癥的作用逐漸成為學(xué)術(shù)界的熱點[11]。星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的神經(jīng)膠質(zhì)細胞類型，通過增生對神經(jīng)退行性疾病做出反應(yīng)，即轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性炎癥狀態(tài)[12，13]。膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)通常用作星形細胞活化的標志物[13]，GFAP免疫染色被認為是鑒定星形膠質(zhì)細胞最常規(guī)的技術(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，2～15月齡雄性3xTg-AD小鼠顯示出明顯的與年齡相關(guān)的GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞染色強度，海馬CA1區(qū)及感覺皮質(zhì)GFAP反應(yīng)性從2月齡就開始逐月齡升高。

神經(jīng)元核(NEUN)是公認的“標記物”，僅在有絲分裂后的神經(jīng)元中被檢測到。在過去的20年中，NEUN被認為是成熟神經(jīng)元的可靠標記[14]。NEUN的表達水平已直接用于評估神經(jīng)元的死亡或喪失，NEUN陽性細胞已成為量化治療研究實驗中治療效果的可靠指標[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，2～15月齡雄性3xTg-AD小鼠與WT小鼠NEUN染色強度均逐漸下降，3xTg-AD小鼠染色強度顯著低于年齡匹配的WT小鼠；NEUN陽性細胞的定量顯示，與年齡匹配的WT組相比，3xTg-AD小鼠6月齡時海馬CA1和CA3區(qū)NEUN陽性細胞數(shù)量顯著減少，CA1區(qū)6～15月齡數(shù)量逐漸穩(wěn)定，CA3區(qū)6～15月齡數(shù)量逐漸降低。

先前研究表明雌性3xTg-AD小鼠表現(xiàn)出較雄性更早的AD病理發(fā)作[16]，這可能是孕酮和雌激素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)機制造成的。雄性和雌性3xTg-AD小鼠在特定的發(fā)作時間和行為表型存在嚴重性差異，同時，每個性別潛在的神經(jīng)炎性狀態(tài)是完全不同的，可能顯著影響基于免疫特定治療劑的功效、安全性，因此必須充分認識到該模型的區(qū)域、時間及性別特定的細微差別和局限性。總的來說，3xTg-AD小鼠在年齡和表型的發(fā)展之間顯示出明顯的相互作用，這使其成為研究衰老在疾病發(fā)病機制中作用的重要工具。