全外顯子組測序檢測22q11.2微缺失綜合征1例*

朱朝鋒,時盼來,焦智慧,孔祥東

鄭州大學第一附屬醫院遺傳與產前診斷中心 450052

22q11.2微缺失綜合征(22q11.2DS)是人類最常見的染色體微缺失綜合征，發病率為1/4 000～1/2 000[1]，由于其臨床表型多樣且部分表型不典型，以及分子診斷技術的滯后，實際發生率可能更高。22q11.2DS大部分是由于非等位基因同源重組導致的新發變異，位于染色體22q11.2區域有0.7～3.0 Mb片段雜合性缺失，累及多系統異常表現，是引起先天性心臟病、發育遲緩和腭裂綜合征的常見遺傳性疾病[1]。22q11.2DS在胎兒中的患病率約為1/1 000，如有心臟檢測結果異常，則發病率可高達1/100[2-3]。因此,對于22q11.2DS的早期診斷和預防具有多種優勢，能夠極大地減少醫療、情感和社會成本。目前，針對22q11.2DS進行產前診斷的方法主要包括染色體微陣列分析(CMA)/全基因組拷貝數變異檢測(CNV-seq)、熒光原位雜交(FISH)和多重連接探針擴增技術(MLPA)等。但由于國內外關于22q11.2DS的研究主要著眼于出生后人群，在產前診斷方面的報道較少，22q11.2DS表型多種多樣，仍然缺乏統一的篩查標準，而且90%以上為新發突變，臨床上難以針對性地進行產前診斷。近年來，全外顯子組測序(trio-WES)技術應用于超聲結構異常胎兒的產前診斷的報道越來越多[4-8]。trio-WES檢測作為一種有效、全面的臨床檢測手段，不受表型的影響，可一次性檢測與大多數疾病相關的基因變異，陽性檢出率提高至30%～60%。本研究通過trio-WES技術診斷出1例22q11.2DS，并通過CNV-seq方法進行驗證，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 孕婦，25歲，孕2產0，因2次胎兒超聲異常妊娠史來本科室進行遺傳咨詢。第1次，孕24周超聲提示胎兒心內膜墊缺失而終止妊娠；第2次，孕20+6周胎兒肺動脈閉鎖伴室間隔缺損經遺傳咨詢后決定終止妊娠。夫妻2人非近親結婚，身體健康，染色體核型檢測均正常(圖1)。本研究經本院醫學倫理委員會批準(批準號Ks-2018-KY-36)，家系成員均知情同意并簽署知情同意書。

注：A為孕婦染色體結果46,XX,22ps+，箭頭所示22號染色體隨體增加；B為配偶染色體檢查結果46,XY。

1.2基因組DNA的提取 采集孕婦及其配偶的外周血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，同時采集引產胎兒皮膚組織，按照QIAamp DNA提取試劑盒操作說明提取全基因組DNA，TE溶液洗脫DNA，并利用NanoDrop紫外分光光度儀測定DNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A)值，得出其濃度及純度，保持A260/A280在1.7～2.0。

1.3trio-WES檢測 trio-WES檢測由北京貝瑞和康生物技術有限公司完成。簡要過程如下：將提取的基因組DNA打斷成250 bp左右片段，經末端修復、接頭連接、純化后利用IDT xGen?Exome Research Panel試劑盒進行全外顯子片段捕獲，構建測序文庫。使用Illumina NovaSeq測序儀(美國Illumina公司)進行讀長為150 bp的雙端高通量測序，測序數據通過質控后進行生物信息學分析。測序數據通過Cruxome全外數據分析系統(北京貝瑞基因公司)進行分析。查閱OMIM、ClinVar、HGMD數據庫進行已知或疑似致病突變篩選，依據美國醫學遺傳學與基因組學學會發布的序列變異解讀標準和指南[9]對變異進行分級，綜合判斷變異的致病性。同時對測序數據進行外顯子捕獲區域基因拷貝數變異(CNV)分析。同批次樣本的全外測序數據經質控后均一化計算，分析外顯子水平的拷貝數變化。最后根據ACMG指南對CNV進行評估和致病性分類。

本研究對孕婦本人、配偶及胎兒全外顯子組測序數據進行分析未檢測到相關致病性單堿基轉換/顛換(SNV)、缺失突變(InDel)變異，但是通過對捕獲區域CNV進行分析，發現胎兒22q11.2區域有約1.41 Mb的雜合性缺失片段(chr22:18893882-20307516)和0.86 Mb的雜合性缺失片段(chr22:20706067-21563420)，變異均來自父親。

1.4CNV-seq 提取并純化后的基因組DNA通過北京貝瑞和康公司科諾安試劑盒進行建庫。構建好的文庫通過Nextseq CN500測序平臺進行單端測序產生8M 36 bp reads，約為0.1X全基因組測序深度。測序數據提交至科諾安分析平臺進行CNV-seq分析。通過CNV-seq方法對胎兒及配偶的全外顯子組測序結果進行驗證，結果發現，胎兒22q11.2區域有約2.58 Mb的雜合性缺失片段(chr22:18900000-21480000)，與配偶的檢測結果相同。

2 討 論

22q11.2DS的臨床表型復雜多樣，給臨床診斷帶來巨大挑戰，22q11.2DS的發生機制目前尚不清楚。22q11.2區域復雜的基因組結構導致生殖細胞在減數分裂時易發生非同源基因同源重組(NAHR)，NAHR可引起22q11.2再發性缺失[1,10]。大約90%的患者有3 Mb大小的典型缺失區域，8%存在1.5 Mb的微小缺失，另外還有一些不典型的小片段缺失和遠端缺失。本研究檢測的胎兒22q11.2DS缺失區域大小約為2.58 Mb(chr22:18900000-21480000)，屬于典型缺失區域。胎兒存在先天性心臟結構畸形，且該家系存在2次胎兒心臟畸形不良孕產史，疾病與22q11.2DS表型相符。本研究中胎兒22q11.2缺失區域遺傳來自父親，但父親表型正常。1例22q11.2DS(chr22:21060359-21461607,hg19)缺失患者主要的臨床表征為重度運動和認知障礙、脊柱裂、脊柱側彎、巨頭畸形、腦積水、小腦發育不全、特殊面容等，其母親攜帶此缺失片段，無明顯臨床表征[11]。1例22q11.2DS(chr22:21046144-21460009,hg19)缺失患者主要的臨床表征為運動延遲、智力障礙、新生兒肌張力減退、腦癱等，其母親攜帶此缺失片段，無明顯臨床表征[12]。因此，22q11.2DS表型的多樣性被認為是遺傳和環境因素共同作用的結果。

22q11.2DS尚無有效的治療手段，目前主要是針對其表型(如低鈣血癥、T細胞功能缺陷、心臟發育異常、學習和語言能力低下等)進行對癥治療。因此，對22q11.2DS進行早期診斷和干預及遺傳咨詢是預防該病發生的關鍵。22q11.2DS發病率高，僅次于唐氏綜合征，但由于其臨床表型復雜，國內對該病的認識不足，未能建立完善的篩查體系，臨床上很多病例仍不能得到確診。目前，FISH技術是22q11.2DS經典的檢測方法，但是其操作相對煩瑣且分辨率十分有限。微陣列芯片(包括微陣列比較基因組雜交或單核苷酸多態性微陣列等)能夠更精確地了解缺失片段的長度，多重連接探針擴增檢測相對更加簡單快速且經濟實用，更適合于對先證者確診后的家系驗證。微陣列芯片及近年來發展的CNV-seq雖能對全基因組范圍內微缺失微重復進行檢測，但其分辨率為100 kb，對于點突變、小片段缺失/重復所致的單基因疾病無法檢測。

trio-WES技術已廣泛應用于臨床遺傳病的檢測，但其主要針對相關基因編碼區序列的SNV和50 bp以內插入InDel，對于染色體拷貝數變異水平的檢測效能還缺乏明確結論。本研究顯示，利用trio-WES技術檢測22q11.2DS被認為是可行的，并且與當前其他現存檢測技術相比具有明顯優勢。trio-WES可一次性檢測人類基因組中約20 000個目標基因，分析相關的致病性SNV、InDel變異，同時還能對捕獲區域進行CNV分析，縮短診療時間，將陽性檢出率提升至30%～60%。22q11.2DS胎兒期臨床表現不明確，目前報道的主要是超聲檢查可見先天性心臟缺陷，其中圓錐動脈干缺陷最常見，其他還有血管異常和左心發育不良。胸腺異常、泌尿系統缺陷及神經系統發育異常也有報道[11]。大多數結構異常要在18～24周通過超聲才能檢測到，因此要求能夠盡快明確診斷。胎兒表型通常不明確，所以trio-WES檢測可能是目前實現快速診斷的最有效的檢測方案[12]。目前，關于trio-WES檢測拷貝數變異的報道還較少，張彥[13]報道了2例遺傳病家系通過trio-WES發現染色體拷貝數變異，片段大小從11.4 kb至13.03 Mb不等，結果得到了CMA等技術的驗證。

總之，本研究通過trio-WES技術對2次孕中期超聲心臟發育異常的家系進行測序，對檢測發現的22q11.2DS缺失區域進行了遺傳學分析和CNV-seq驗證，明確了22q11.2DS約2.58 Mb雜合性缺失是其致病性變異，為該夫婦進行再次生育給予指導并提供了有效的遺傳咨詢。trio-WES技術應用于22q11.2DS的基因診斷是可行的。trio-WES技術應用于其他微缺失微重復綜合征還需要更多的數據評估和驗證。