Klotho、Caspase-3、Bcl-2表達水平評估急性腦梗死疾病發展程度的診斷價值

徐文武，汪 昆

青海省心腦血管病專科醫院神經內科，青海西寧 810000

急性腦梗死(ACI)是腦局部血液供應障礙引發的疾病，臨床常見于缺血、缺氧引起局限性腦組織壞死、神經元損傷凋亡而發病，具有極高的致殘率和致死率[1]。ACI病情發展迅速，如果發現后治療不及時往往會引起嚴重后果，甚至威脅生命。有研究報道，ACI發病后可能出現遲發性神經元損傷[2]，但目前臨床上尚缺乏效果十分明顯的檢測和治療手段。有研究發現，細胞凋亡在ACI進展過程中起重要作用，而克老素(Klotho)主要表達于腎臟和腦組織，可通過調節多種信號通路發揮抗凋亡作用[3]。有研究表明，Klotho可作為腦缺血的獨立影響因素而存在[3]。此外，半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性受B細胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)的調節，也在ACI的發生和發展中扮演著重要角色[4]。本研究采用前瞻性研究方法，探討ACI患者血清Klotho、Bcl-2和Caspase-3的變化規律，并探究其臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年3月至2017年3月在本院急診科接受診斷和治療的110例ACI患者作為研究組，其中男62例，女48例；年齡48～79歲，平均(60.43±4.37)歲；發病時間0.50～10.00 h，平均(4.57±0.83)h；其中合并高血壓68例，合并高血脂69例，合并糖尿病60例。同時選取在本院進行體檢的100例不合并腦部疾病者作為對照組，其中男48例，女52例；年齡44～77歲，平均(58.86±4.51)歲。兩組研究對象性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究已經通過本院倫理委員會批準。

1.2納入和排除標準 納入標準：(1)年齡40～80歲；(2)經頭部磁共振掃描或CT掃描符合關于ACI的診斷標準；(3)ACI首次發病患者；(4)患者直系親屬簽署知情同意書；(5)入院后按照《中國腦血管病防治指南》[5]進行診斷和治療。排除標準：(1)既往有卒中病史的患者；(2)合并其他神經內科疾病的患者；(3)合并顱腦疾病或外科創傷的患者；(4)合并精神異常、意識障礙的患者；(5)合并嚴重肝腎疾病的患者；(6)合并惡性腫瘤的患者；(7)臨床資料不全或中途退出的患者。

1.3病情評價方法 分別在梗死后12 h、1 d、5 d和10 d通過磁共振掃描檢測腦梗死病灶的體積[6]，腦梗死病灶體積(V)=病灶長度×直徑×陽性層數×層厚×π/6。小梗死組：V≤4.0 cm3，中梗死組：4.0 cm314分為重度缺損。

1.4檢測方法 ACI患者在入院當天和入院后12 h、1 d、5 d和10 d及對照組體檢當天抽取外周靜脈血5 mL，離心分離血清后置于-80 ℃保存備用，采用酶聯免疫吸附試驗檢測Klotho、Bcl-2和Caspase-3水平，試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司，嚴格按照說明書進行操作和結果判讀。

2 結 果

2.1兩組血清Klotho、Bcl-2和Caspase-3水平比較 研究組患者在梗死后12 h和1 d血清Klotho水平較對照組均明顯降低，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。各項指標分別在1 d左右達到最高或最低峰值。見表1。

表1 兩組血清Klotho、Bcl-2和Caspase-3水平比較

2.2研究組梗死1 d時不同梗死體積和不同缺損程度患者血清Klotho、Bcl-2和Caspase-3水平比較 研究組不同梗死體積患者血清Klotho水平低于對照組，Caspase-3和Bcl-2水平均高于對照組，大梗死組和中梗死組患者血清Klotho水平均明顯低于小梗死組，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯高于小梗死組，大梗死組患者血清Klotho水平明顯低于中梗死組，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯高于中梗死組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。神經功能輕中度、重度缺損組患者血清Klotho水平均明顯低于對照組，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯高于對照組，神經功能重度缺損組患者血清Klotho水平均明顯低于輕中度缺損組，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯高于輕中度缺損組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 研究組梗死1 d時不同梗死體積患者血清Klotho、Bcl-2和Caspase-3水平比較

表3 研究組梗死1 d時不同缺損程度患者血清Klotho、Bcl-2和Caspase-3水平比較

2.3梗死1 d時血清Klotho、Bcl-2和Caspase-3水平與梗死體積和NIHSS評分的相關性 血清Klotho水平與梗死體積和NIHSS評分均呈負相關(P<0.05)，而Bcl-2和Caspase-3水平與梗死體積和NIHSS評分均呈正相關(P<0.05)，見表4。

表4 梗死1 d時血清Klotho、Bcl-2和Caspase-3水平與梗死體積和NIHSS評分的相關性

3 討 論

隨著我國人口老齡化的加劇和人們生活水平的提高，ACI的發病率越來越高，若不能對病情進行及時判斷并接受及時有效的醫治會引起嚴重的后遺癥，甚至會影響生命[5]。近年來，關于可以指導ACI診斷并判斷預后的方法(如血清標志物檢測)引起了研究者的興趣，這些血清標志因子靈敏度較高，并且檢測機械化程度也較高，可快速評估病情的進展情況，進而采取更有效的措施，目前凋亡相關血清標志因子與ACI病情發展和預后的關系是研究熱點[6]。

本研究發現，發生腦梗死后凋亡蛋白Caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2水平均升高。有研究顯示，Klotho具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用，從而在一定程度上使疾病的預后更好[7]。Caspase是凋亡的主要執行蛋白，Caspase-3是其中最重要的成員。本研究結果顯示，研究組患者在梗死后12 h和1 d血清Klotho水平明顯降低，而Bcl-2和Caspase-3水平明顯升高，各項指標分別在1 d左右達到最高或最低峰值，而后在10 d內恢復至與對照組相似的水平。此外，大梗死組和中梗死組血清Klotho水平明顯低于小梗死組，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯高于小梗死組，大梗死組血清Klotho水平均明顯低于中梗死組，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯高于中梗死組。神經功能重度缺損組血清Klotho水平均明顯低于輕中度缺損組，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯高于輕中度缺損組。血清Klotho水平與梗死體積和NIHSS評分均呈負相關(P<0.05)，而Bcl-2和Caspase-3水平與梗死體積和NIHSS評分均呈正相關(P<0.05)。說明ACI發病后，Klotho、Bcl-2和Caspase-3均參與了ACI的病情進展及神經功能損傷過程，可能成為判斷ACI嚴重程度和預后的血清標志物。(1)抑制經典衰老信號通路胰島素/胰島素樣生長因子，從而抑制衰老進程，延長壽命[4]；(2)抑制經典致纖維化信號通路轉化生長因子-β1，不僅能夠治療腎纖維化，還可以抑制癌癥轉移[8]；(3)抑制P53/P21信號通路，從而通過調控細胞周期抑制細胞凋亡來對抗衰老[9]；(4)激活TRPV5離子通道，參與鈣穩態的維持[5]；(5)激活cAMP/PKA信號通路，從而抑制過度的氧化應激反應[6]；(6)抑制WNT信號通路。在體內及體外試驗中均發現WNT能夠加快細胞衰老，而循環型和膜上的Klotho都可以與WNT蛋白結合，從而以抑制該信號通路來抗衰老[9]。此外，Klotho是成纖維細胞生長因子23的共受體，可能與主要作用于磷酸鹽穩態存在關聯。

關于Klotho與腦梗死的研究近年來才引起國內學者的關注，以往研究顯示，Klotho蛋白高表達可以延緩高血壓病程及心臟靶器官損傷，Klotho是腦梗死的獨立危險因素[10-11]；腦卒中發生后Klotho水平明顯降低，是腦卒中的獨立危險因素[12]。而張紅艷等[13]研究也發現，經過治療后Caspase-3水平明顯降低，并且療效越優的患者血清Caspase-3水平越低。另有研究結果顯示，在大鼠腦室內給予 Caspase抑制劑，能夠緩解腦缺血后神經元死亡并減少梗死體積，Caspase抑制劑可對神經元的損傷起治療作用[14]，說明ACI發病后Caspase-3與神經元損傷密切相關。本研究發現，不同梗死體積患者血清Klotho水平低于對照組，Bcl-2和Caspase-3水平均高于對照組，大梗死組和中梗死組血清Klotho水平均明顯低于小梗死組，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯高于小梗死組，大梗死組血清Klotho水平明顯低于中梗死組，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯高于中梗死組；神經功能輕中重缺損組血清Klotho水平均明顯低于對照組，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯高于對照組。關于Bcl-2和Caspase-3研究主要集中在腫瘤、神經退行性疾病、心血管疾病及代謝性疾病等方面。有研究顯示，在顱內出血性病變中，細胞自噬的改變和調控在血腦屏障損傷與保護中起重要作用,且有多種細胞因子參與此過程[12，14-15]。

本研究顯示，腦梗死后Bcl-2水平會升高，并通過降低神經元細胞的抗凋亡能力參與梗死后神經損傷。而周賓等[15]研究結果發現，在腦缺血-再灌注后缺血伴暗帶頂葉皮質 Bcl-2 的mRNA 水平明顯升高，在缺血后7 d仍存在Bcl-2水平升高，與近年來研究報道結果一致[16-17]。本研究結果顯示，梗死后Bcl-2水平高于對照組，且在1 d時水平最高，5 d后開始下降，這可能是由于本研究中患者入院時距離梗死發作的時間較短，均在10 h內接受治療，而患者本身的刺激也會適應性上調抵抗損傷[18]。

綜上所述，在ACI急性發作期血清Klotho水平明顯降低，而Bcl-2和Caspase-3水平均明顯升高，并且血清Klotho水平與梗死體積和NIHSS評分均呈負相關，而Bcl-2和Caspase-3水平與梗死體積和NIHSS評分均呈正相關，說明其可作為判斷ACI嚴重程度和預后的血清因子。但本研究病例數較有限，并且具有一定的地域局限性，同時，標本收集保存后統一檢測缺乏一定的時效性，需進行進一步研究。