γ干擾素釋放試驗在不同年齡肺結核患者中陽性程度比較

胡開明，王 席，陶 芳，朱 梅

安徽醫科大學附屬巢湖醫院檢驗科，安徽合肥 238000

結核病是由結核分枝桿菌引起的致死性傳染病。據WHO估計，每年新發結核病患者1 000萬，約有150萬結核病患者死亡，位居各種傳染病致死原因之首[1]。早期、準確識別結核病對及時分診、快速啟動抗結核治療，從而控制結核病傳播有重要意義。目前結核病診斷試驗中，γ干擾素釋放分析因其較高的特異性和敏感性越來越受到重視，已被納入各種診療指南或專家共識[2-3]，但各種分析報道有較大差異[4-7]。有研究分析發現，γ干擾素釋放試驗(TSPOT.TB)結果可能會受免疫狀態、年齡、體質量指數(BMI)、淋巴細胞數等因素影響[8]。本研究在平衡性別、病程、BMI、免疫狀態等因素后分析不同年齡肺結核患者TSPOT.TB陽性程度的變化，為該試驗在臨床的合理應用提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年6月至2018年6月入住本院的TSPOT.TB結果為陽性的245例初治肺結核患者作為研究對象，所有病例診斷均按照肺結核診斷標準：WS288-2017[9]執行，其中男198例，女47例；痰涂片和/或培養陽性85例，涂陰160例。TSPOT.TB在入院后1周內完成檢測且采集外周血時未啟動抗結核治療。根據年齡分為3組，其中青年組(18～44歲)102例，中年組(>44～59歲)39例，老年組(>59歲)104例。分別回顧性分析各組患者性別、BMI、吸煙史、病程(從發病到檢測間隔時間)等資料，其中BMI分為<18.5 kg/m2、18.5 kg/m2≤BMI<24 kg/m2及≥24 kg/m23個等級。所有病例均排除乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、人類免疫缺陷病毒感染、惡性腫瘤、妊娠、免疫抑制劑用藥史。

1.2試劑與儀器 人外周血單個核細胞分離液、RPMI1640細胞培養液、AIMV細胞培養液為天津灝洋生物制品有限責任公司產品，TSPOT.TB為英國Oxford Immunotech 公司產品，CO2培養箱為三洋公司產品，離心機為安徽中科中佳科學儀器有限公司產品。

1.3方法 TSPOT.TB： 在抗結核治療前用肝素鋰抗凝管采集外周靜脈血5 mL，淋巴細胞分離液分離得到外周血單個核細胞(PBMC)，洗滌2次后用AIMV細胞培養液調整細胞濃度為 2.5×105/mL。每份待測樣本取出4個細胞培養孔，分別加入ESAT-6(抗原A)、 CFP-10(抗原B)、RPMI1640(陰性對照)及 PHA(陽性對照)各50 μL，再加入調制好的細胞懸液100 μL，37 ℃、5%CO2環境孵育16～20 h。取出培養板用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌4次后加入50 μL酶標二抗工作液(原液用PBS稀釋200倍，用時配制)4 ℃孵育1 h。洗滌4次后加入50 μL顯色液，避光顯色7 min后，用蒸餾水終止反應，干燥后計數抗原A孔和抗原B孔的斑點形成細胞數量(SFCs)，根據試劑盒說明書提供的標準判斷試驗結果。

1.4統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件進行數據分析處理。非正態分布的計量資料以M(P25～P75)表示；計量資料及構成比比較分別采用Kruskal WallisH檢驗和χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13組肺結核患者臨床資料比較 3組肺結核患者性別、吸煙史、病程及BMI比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組肺結核患者臨床資料比較

2.23組肺結核患者TSPOT.TB的SFCs比較 青年組肺結核患者抗原A、抗原B及抗原A+抗原B的SFCs分別為49.5(29.5～105.0)、80.0(32.5～151.3)及 138.0(80.3～223.5)；中年組肺結核患者分別為32.0(18.0～75.0)、37.0(21.0～126.0)及103.0(48.0～206.0)；老年組肺結核患者分別為15.5(9.0～32.0)、18.5(6.0～49.8)及38.5(21.0～79.5)。經統計分析顯示，青年組及中年組肺結核患者抗原A、抗原B及抗原A+抗原B的SFCs均明顯高于老年組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 3組肺結核患者的SFCs比較

2.33組肺結核患者不同程度陽性結果的構成分布 根據SFCs將低于下四分位數(P75)的結果定義為強陽性，進一步分析年齡與陽性程度之間的關系。青年組、中年組及老年組肺結核患者抗原A刺激孔SFCs為弱陽性的構成比分別為10.5%、12.3%、77.2%，強陽性的構成比分別為67.7%、19.4%、12.9%；抗原B刺激孔SFCs弱陽性的構成比分別為21.8%、9.4%、68.8%，強陽性的構成比分別為65.6%、21.3%、13.1%；抗原A+抗原B刺激孔SFCs弱陽性的構成比分別為3.4%、8.7%、87.9%，強陽性的構成比分別為66.7%、20.0%、13.3%。3組肺結核患者抗原A刺激孔SFCs、抗原B刺激孔SFCs及抗原A+抗原B刺激孔SFCs比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。Gmma系數分別為-0.876、-0.765及-0.945。見表2～4。

表2 3組肺結核患者TSPOT.TB抗原A刺激孔SFCs結果陽性程度分布(n)

表3 3組肺結核患者TSPOT.TB 抗原B刺激孔SFCs結果陽性程度分布(n)

表4 3組肺結核患者TSPOT.TB抗原A+抗原B刺激孔SFCs結果陽性程度分布(n)

3 討 論

中國作為30個結核病高負擔國家之一，每年新增近90萬活動性肺結核患者[1]。第五次全國結核病流行病學調查顯示，肺結核的發病率隨著年齡增加呈逐漸上升趨勢，在75～80歲達高峰，菌陽和涂陽肺結核病例也呈現類似變化趨勢，因此，加強對老年肺結核患者的診斷和治療對我國結核病防治工作有積極意義[10]。傳統的實驗室檢測方法具有耗時長、靈敏度低、假陽性高等缺點，再加上老年結核病患者臨床癥狀常不典型，這些因素都給老年結核病的診斷帶來一定困難[11-12]。TSPOT.TB是利用酶聯免疫斑點技術，將結核桿菌特異抗原A和抗原B在體外與PBMC共孵育，通過檢測分泌干擾素-γ的效應T細胞數量判斷機體有無結核桿菌感染。多種報道顯示，TSPOT.TB的敏感性存在較大差異[5-6,13]。進一步分析表明，年齡、BMI、病程、人類免疫缺陷病毒感染、人類白細胞抗原多態性等因素可能是造成試驗敏感性降低甚至呈假陰性的因素[8,14]。本研究在平衡性別、BMI、病程、吸煙史等因素后觀察不同年齡肺結核患者TSPOT.TB的SFCs變化趨勢，結果表明，肺結核患者隨著年齡的增加，抗原A刺激孔、抗原B刺激孔及抗原A+抗原B刺激孔的SFCs均呈下降趨勢，老年組SFCs下降最明顯。

既往研究顯示，隨著年齡增長，免疫系統不可避免地會發生衰退，其機制涉及免疫器官、免疫細胞和免疫分子各種水平，如樹突細胞對抗原攝取及其成熟能力、外周T細胞數量的穩定及分化、增殖及效應分子分泌能力等[15]。動物模型研究顯示，老年鼠在感染結核后，體內結核抗原特異性T細胞分泌γ干擾素的能力明顯降低[16]。因此，老年肺結核患者結核感染T細胞試驗中檢測斑點數量下降可能與免疫系統的衰退有關，這也提示在將此試驗用于肺結核診斷時應考慮年齡因素對試驗結果造成的影響。為了避免此種情況可能造成的漏診，在結核感染T細胞試驗中引入其他結核特異性抗原或同時檢測多種效應分子(腫瘤壞死因子-α或白細胞介素-12)是一種可行的診斷方法。