VISA/VRSA相關耐藥進化史及耐藥進化代價*

羅云桃，夏啟航，王慶忠 綜述,王敬華 審校

上海市臨床檢驗中心，上海 200126

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)是常見臨床病原分離菌，其多重耐藥不斷挑戰臨床治療底線。如今，由于患者病理特點各異，臨床醫生已無法從經驗性用藥策略獲得更多收益。即使萬古霉素作為臨床一線治療最有效的藥物，也出現了萬古霉素中度耐藥性金黃色葡萄球菌(VISA)/耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)的報道。人們把這類難治性、泛耐藥細菌稱為超級細菌，并開始對其是否會突破萬古霉素最后的防線而感到擔憂。隨著越來越多VISA/VRSA耐藥機制的揭示，研究人員認識到金葡菌為抵御外部不利因素，自身擁有一套完整且復雜的生物進化體系。通過進化適應性成本交換，金葡菌獲得存活于外部環境的能力。在演進過程中，金葡菌往往也產生其他關聯的代償性生理結構和功能性改變。本文通過對金葡菌的相關耐藥進化史進行回顧性分析，從細菌生物進化角度客觀討論目前VISA/VRSA的現狀和對臨床治療策略的影響。

1 金葡菌耐藥進化史

1.1耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)耐藥史 抗菌藥物用于抗菌治療初始于1941年的青霉素，那時的療效曾讓醫生樂觀認為，所有微生物感染疾病是可以通過抗菌藥物有效治療的,但青霉素投入臨床不久便迅速出現了耐青霉素金黃色葡萄球菌(PRSA)。當時的這種PRSA被命名為噬菌體型80/81，并于20世紀50～60年代在醫院和社區引起流行[1]。隨后甲氧西林以一種半合成β-內酰胺類抗菌藥物，于1959年被引入治療PRSA感染，但在臨床使用2年內也迅速出現了MRSA菌株，其中一種COL菌株成為20世紀60～70年代歐洲主流傳播菌株[2]。20世紀70～80年代新一輪的MRSA菌株在美國出現并隨后在世界范圍流行[1,3]。20世紀90年代，MRSA繼而進入社區引起大范圍感染(CA-MRSA)[2]，并流行至今。

1.2VISA和VRSA的耐藥史 由于純化藥物技術障礙、藥物腎毒性的因素，同時存在其他一些可用β-內酰胺酶類抗菌藥物，萬古霉素一直未在臨床大量推廣。20世紀80年代，當MRSA泛濫難治，針對MRSA的改良型萬古霉素才大量使用。此后，萬古霉素耐藥腸球菌在20世紀80年代后期出現。而后，公認的VISA/VRSA報道分別為1996年的日本(VISA)和2002年的美國(VRSA)。不過回顧文獻，萬古霉素敏感性降低金葡菌株的出現最早可追溯到1987年[3]。

2 VISA/VRSA耐藥相關進化及代價

VISA/VRSA耐藥機制隨菌株遺傳背景和環境異質性而復雜多變。在各種條件下，萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌(VSSA)演變成VISA/VRSA的過程并非類似。為獲得相應適應力，菌種會以不同進化方式形成某些改變，包括自身方式，如基因突變、調控；也包括菌群間，如菌落亞群的更替、菌群的競爭抑制等。

2.1VISA/VRSA分子水平突變進化 在細菌基因組測序技術未能普及臨床檢測之前，對于VISA/VRSA的分子耐藥機制，學者們并不十分清楚，認為VISA和VRSA是各自遵循獨立的進化路線[4]。比如VISA，世界多地病例通常與住院、持續感染、長期應用萬古霉素治療有關。一般認為，VISA是在依賴萬古霉素環境壓力下導致的長期表觀進化結果，而非基因組突變引起。為適應外部環境作出的成本代價，一般細菌相關基因調控遠比本身基因突變來得容易。不過，基因調控往往適應度有限，這也能在一定程度上解釋臨床分離VISA的最小抑菌濃度(MIC)值僅呈輕中度升高[4]。再者，表觀調控往往可逆。許多研究報道，VISA的抗藥性不穩定，在無萬古霉素環境壓力下往往會恢復至VSSA狀態[4-6]。而較之VRSA，之前的研究僅發現其高濃度的萬古霉素耐受性(MIC≥16 g/mL)是由外源性耐萬古霉素腸球菌接合質粒(Tn1546轉座子編碼的vanA 操作子)水平轉移至VSSA，導致其基因組的改變[3]。

隨著現代微生物分子技術的臨床推進，對之前VISA/VRSA的理解有了明顯完善。VISA的分子進化不僅限于萬古霉素藥物壓力下的基因調控表達或單基因位點突變。最近已發現眾多基因位點變異與萬古霉素MIC值中度增高相關，最主要的有ropB (編碼DNA依賴的RNA聚合酶亞單位)及walKR、vrsSR和graSR (編碼雙組分調節系統)[5]。CHEN等[6]通過全基因組測序比對同源VSSA和VISA發現，菌株在分子進化中2個重要的遺傳變異步驟分別伴隨著VSSA至異質性VISA(hVISA)和hVISA至VISA的表型轉換。VSSA至hVISA轉變中，hVISA 菌株的基因變化包括基因agrC位點丟失及編碼具有多種酶活性蛋白的5個非同義突變；hVISA至VISA轉變中，有rpoB和fusA突變介入。VIDAILLAC等[7]更進一步指出，在不同的外部環境下，即使是具有相同基因背景的菌株，VSSA至VISA的基因突變路徑也有巨大差異。對于非外源性DNA介入的VISA，往往是多步驟、多環節上基因突變的累加導致MIC值逐步增高。同樣，對于未攜帶外源性vanA基因的VRSA，KIM 等[5]也以類似同源VSSA與VRSA基因比對方法研究發現，子代VRSA具有8個非同義突變，同樣可由自身基因組改變導致高耐藥性，其中發現的相關基因RimM、rpsK往往參與細胞分裂、生長速率、生物膜形成；KIM 等[5]還發現了一些存在于VISA的其他突變基因，比如vrat、walk和rpob，它們都與后續的轉錄調控有關。因此，VISA/VRSA并不是以往認為的各自具有獨立耐藥進化機制，在臨床治療環境下，二者之間存在某些互相進化遞進關聯，分子耐藥機制更復雜多變。

2.2hVISA在菌群內異質性進化 菌群異質性已被證實于各類菌種內。金葡菌小克隆菌落變異(SCV)往往是多種耐藥菌的來源，它們與整體菌群相比較，為適應環境壓力作出了很多生理上的改變[8-9]。hVISA可看作是耐萬古霉素SCV其中的一個特別分支，具有相關生理代謝上的改變，如生長緩慢、形態變化等[10]。最近國外文獻頻繁用到“creep”一詞來描述hVISA的MIC值變化狀態[11]，借以說明在萬古霉素MIC敏感范圍內，金葡菌菌群內存在小比例的hVISA (10-6～10-5cfu)[12]，并在長期萬古霉素治療壓力下，hVISA所占比例上升而整體MIC值增高，hVISA最終成為優勢適應菌替代原有VSSA菌群。因此，hVISA可看作是VISA的前置過渡狀態。不過對于hVISA的來源存在很多爭議：是經歷了長期藥物壓力誘導其基因選擇突變，還是hVISA本身就異質性地自發存在于VSSA菌落內，對于這樣的問題，可結合VISA菌種不同分布來源解答[13-14]。據報道，hVISA并不特定于醫源性感染的菌群內[2]，有些hVISA并未接受過藥物的選擇，基于這一現象，某種程度上可以說，hVISA這類異質群體是可自發存在于自然環境下的。生物物種的基因多態性賦予了物種適應力的多樣性，這也同樣存在于金葡菌菌群內。在無外界選擇壓力的進化中，獲得隨機性的耐藥表型，比如VSSA內小比例hVISA的天然存在。當處于治療劑量的萬古霉素壓力下，hVISA以取代菌落內其他VSSA的方式為代價[15]，迅速發展為VISA菌群，這可解釋許多臨床未經預治療，MIC整體處于敏感范圍的VSSA僅在短期治療干預后就會出現VISA的情況。臨床不僅需注意長期應用萬古霉素治療后的VISA，對于短期治療下出現hVISA的可能性也不容忽視。

2.3VISA菌群間競爭抑制性進化 不同細菌間存在競爭抑制性，分泌酶類、抗菌藥物、細胞因子等壓制其他微生物以獲取同環境下更多的生存空間和資源[16]，最近有文獻揭示，同一金葡菌菌群內部也存在這種情況，以同類競爭抑制作為進化代價。KOCH等[17]研究發現，在對MRSA分離菌株進行培養的過程中，可明顯辨別出2個不同的、依次出現的菌落群體。在沒有外部環境壓力下，第1個衍生出自原菌落的菌株通過分泌毒素因子而壓制該菌群的其他群體。隨著培養持續，后續出現的第2種菌落能對第1種細菌分泌的毒素自行產生抗性。重要的是，經藥物測試，第2種自帶抗性的菌株會天然對一些抗菌藥物產生抗性，包括VISA[16]。KOCH等[17]等的研究提示了另一種VISA進化模式，這類實驗模型能完好地解釋臨床某些VISA能夠在未使用任何抗菌藥物的條件下自發產生；ZHU等研究[18]認為，這種現象在臨床上往往需要病灶內大量細菌數量的聚集，如深部感染傷口、膿腫厭氧部位等，對于此類隱秘性環境，藥物往往在病灶內達不到最佳殺菌濃度。臨床上初治時更應考慮感染確切部位，或介入外科引流、切除等手段，而非直接進行藥物治療策略。

2.4VISA/VRSA生理和功能進化 為適應萬古霉素壓力，VISA/VRSA會存在形態和生理改變[10]，并隨環境壓力的撤除，VISA/VRSA適應性代價(比如生長速率、毒力減弱等)往往具有可逆性[19]。

2.4.1形態和代謝改變 VISA/VRSA較易形成生物膜及細胞壁增厚，這些適應性有助于細菌抱團聚集，抵御外部萬古霉素滲透[19]。VISA生物膜和細胞壁由關鍵的附屬基因調節因子(Agr)調控，起群體感應作用，使新生細胞壁合成增加及衰老細胞壁自溶力下降。不過，VISA/VRSA適應性代價具有多面性關聯，耐藥性的獲得伴隨相應其他生理的補償影響，如衰老細胞壁增厚會導致菌體物質交換能力下降及生物膜形成影響內部生存空間等。有研究稱，生物膜內部會造成厭氧或缺氧，導致細菌只能處于半靜止、低代謝狀態[20]。生理上相應的有些進化代價對細菌生長不利，但也有利于耐藥菌成為持留菌，如半靜止、低代謝狀態的VISA/VRSA往往菌體分裂減少或停滯，使許多針對細胞對數生長期的藥物治療失敗。低活力、休眠態有點類似于芽孢自我保護性結構，能抵御不利環境壓力，長期存活。

2.4.2毒力性改變 有研究認為，VISA/VRSA存在毒力減弱現象[21]，與Agr系統下調有關[15]，導致相關毒性基因表達下降，如hla、 hlb、coa等[1，22-23]。VISA/VRSA毒力減弱是一種適應性改變，同時也是細菌自我保護的一種隱秘策略[21]。VISA/VRSA的毒力減弱，弱化了菌體相關抗原的識別，易于逃逸宿主免疫系統。因而，臨床上如果使用次優方案行萬古霉素治療，可能會誘導菌群從一種抗菌藥物敏感和毒力較強的狀態演變為另一種抗菌藥物耐藥而毒力較弱的狀態，造成殘留VISA/VRSA菌群持續感染。

2.5VISA/VRSA側支耐藥 有研究認為，VISA/VRSA獲得萬古霉素敏感性減弱的同時，會提高對β-內酰胺類藥物的敏感性(拉鋸效應)[24]。但反過來，長期只接受β-內酰胺類藥物治療，體內金葡菌對β-內酰胺類藥物產生抗性的同時，不會誘導其對萬古霉素的敏感性增強，更多為耐藥[25]。不過目前拉鋸效應用于臨床存在很多爭議。有研究顯示，金葡菌菌株耐藥進化有很大不確定性[24]，這類似于細菌抗菌藥物側支敏感/耐藥的概念[15，26]。最近有研究通過多種藥物兩兩組合模型，分別對大腸埃希菌做了藥敏重復性試驗[27]。有研究發現，同樣的菌株在產生第1種藥物耐藥后會對第2種藥物在產生側支敏感性上有很大的隨機性[26-27]。產生隨機性的影響因素很多，比如自身細胞結構、基因改變和外部環境等。有研究表明，細菌對第1種抗菌藥物耐藥時，對其他多種藥物產生的是側支耐藥性而非敏感性增加[27]。金葡菌的拉鋸效應應歸屬于細菌的抗菌藥物側支敏感/耐藥范疇。鑒于臨床來源的VISA/VRSA遺傳背景、醫療環境各異，因此，對于二線抗菌藥物的替代治療更應遵循現代循證用藥而非傳統經驗用藥。

3 VISA和VRSA尚未泛濫現狀分析

目前VISA/VRSA并沒有到如MRSA泛濫成災的現狀，但很多學者認為，這也許是時間早晚的問題。不過結合相關資料不難發現，的確有些因素導致目前還不流行。

3.1特定環境 VISA/VRSA的來源多是住院患者，與持續感染、萬古霉素治療有關。長期藥物選擇壓力，導致了VISA的逐步演變[21，28]。不過選擇進化是有代價的，醫源性VISA/VRSA生物適應力的特定性，并非能適應醫療外環境[29]，這與當時某些在醫療系統的MRSA菌株不能進入社區流行類似[2]。

3.2檢出率 VISA耐藥表型存在可逆性。隨著環境改變，如冷凍復蘇、撤藥等，VISA會恢復到敏感狀態，并且藥敏測試只針對于對數生長期的菌群，而處于深部膿腫、相對厭氧環境的VISA菌群則易處于靜止期[23]。VISA/VRSA生長緩慢，常規臨床藥敏試驗周期并不足夠覆蓋；MIC為1～2 μg/mL的VSSA依然存在hVISA一定概率的漏檢[8]。

3.3折點 2006年，美國臨床和實驗室標準協會重新下調了萬古霉素藥敏判定折點(MIC:2 μg/mL敏感，4～8 μg/mL中介，16 μg/mL耐藥)。折點上的改變，對于之前的研究數據，很多臨界值的VISA將被落入統計外。

3.4譜系特異 對于外源性vanA轉移獲得的VRSA，由于質粒高度不穩定性、基因水平轉移偶然性及質粒自帶限制性修飾系統[19，30]，導致相應耐藥獲得的罕見性，如只存在特定的醫源性金葡菌菌株上[31]。

4 臨床影響

近年來，現代抗感染策略正在發生巨大改變(表1)，比如萬古霉素的MIC值不僅可作為用藥的監測手段，也可作為臨床復發后的預后指標[12，32]。

表1 現代VISA/VRSA研究治療策略的轉變

5 小 結

VISA/VRSA在一系列適應性演變過程中，其首要目的是選擇適合的進化代價以獲得對萬古霉素的適應力，在此過程中，其自身基因、生理狀態會發生相應變化。菌種不同改變會造成臨床治療效果的隨機性和不確定性。如何目的性、個性化治療是研究人員和臨床醫生需要考慮的新思路。而個性化治療的前提是必須充分掌握微生物學證據，這些證據可以從VISA/VRSA基礎研究、臨床大數據、實驗室檢測等獲得。隨著微生物檢測技術不斷更替，相信越來越多的確實證據會指導臨床治療策略更完善。