miR-27a及其靶標PPAR-γ與冠心病合并2型糖尿病的相關性分析*

黃昌志，許學忠，劉小菁

1.海南省萬寧市人民醫院急診內分泌科，海南萬寧572000；2.海南省萬寧市婦幼保健院藥劑科，海南萬寧571500

2型糖尿病(T2DM)是冠心病(CAD)的高風險因素之一[1]。微小RNA(miRNA)已經成為多種疾病預測或診斷中最具潛力的生物學分子[2]。CHEN等[3]研究發現，miR-27a能夠通過靶向抑制過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)表達促進胰島素抵抗并影響糖脂代謝。PPAR-γ屬于一類配體激活轉錄因子，在控制糖脂代謝過程中發揮關鍵作用[4]。目前，已知PPAR-γ與多種代謝性疾病有關，如高脂血癥、糖尿病和CAD[5]。為了明確miR-27a在預測CAD合并T2DM方面的作用，本研究分析了CAD、T2DM及CAD合并T2DM患者中循環miR-27a及其靶點PPAR-γ的表達差異。

1 資料與方法

1.1一般資料 經萬寧市人民醫院醫學倫理委員會批準，并提供書面知情同意書。選取萬寧市人民醫院2018年12月至2019年12月的147例受試者作為研究對象，男89例，女58例，年齡37～82歲，平均(54.39±12.95)歲。男選取36例健康人群作為對照組，空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血生化指標均正常；既往無T2DM、高血壓、CAD或其他心血管疾病史，入組前3個月未因任何慢性疾病服用藥物。選取38例單純T2DM患者作為T2DM組，根據美國糖尿病協會指南[7]，患者HbA1c水平≥6.5%，無其他糖尿病并發癥，且排除不穩定型心絞痛患者、無創心功能檢查陽性、腦血管疾病、冠狀動脈疾病、外周動脈疾病、急性冠狀動脈綜合征者。選取36例單純CAD患者作為CAD組，根據陽性病史(心肌梗死、心絞痛和冠狀動脈旁路移植術)和/或常規12導聯心電圖上的缺血性變化(包括ST段壓低或Q波改變)和/或血管造影結果(至少有1根冠狀動脈狹窄>70%)診斷。選取37例CAD合并T2DM患者作為CAD-T2DM組，診斷為CAD，且患者HbA1c水平≥6.5%，具有T2DM病史。除上述以外，所有研究對象還需排除1型糖尿病、腦卒中、心肌梗死、惡性腫瘤、肝腎功能障礙、慢性炎癥、自身免疫性疾病。

1.2方法

1.2.1人體測量學和生物化學測量 采用標準公式[體質量(kg)/身高2(m2)]計算體質量指數(BMI)。此外，使用標準血壓計測量研究對象休息15 min后的收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)。禁食8 h以上收集所有研究對象的靜脈血，檢測FBG、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和肌酐(Cr)。另外采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定空腹胰島素(Fins)水平。胰島素抵抗指數(HOMA-IR)的計算公式如下：HOMA-Ir=[FBG(mg/dL)]×[Fins(μU/mL)]/405。

1.2.2采用實時熒光定量PCR檢測血清miR-27a表達水平 抽取靜脈血10 mL，使用750 μL TRIzol?LS試劑(美國Invitrogen公司)從250 μL血清中提取循環RNA，并用35 μL預熱(65 ℃)洗脫液進行洗脫。血清與三唑醇混合后，加入10 μL秀麗隱桿線蟲miR-39(0.05 μmol/L，由中國上海基因公司合成)。使用NanoDrop 1000(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行RNA定量。用Taqman MicroRNA反轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)進行反轉錄。qPCR在20 μL體積反應中進行，并用Bio Rad IQ5熱循環儀(美國Bio Rad Laboratories公司)進行熱循環處理：94 ℃ 1 min，然后94 ℃ 15 s+60 ℃30 s循環40次。使用2-ΔΔCq方法計算miR-27a相對于其內參的表達水平。引物序列如下：miR-27a正向為5′-GCG GAA CTT AGC CAC TGT GA-3′；反向為5′-TGA GGA GCA GGG CTT AGC TG-3′。

1.2.3血清PPAR-γ水平檢測 根據制造商說明書，采用人PPAR-γ ELISA試劑盒(美國Protein Tech公司)檢測血清PPAR-γ水平，在450 nm波長處測定吸光度(A值)。根據擬合的標準濃度A值曲線計算血清樣本中PPAR-γ水平(pg/mL)。

1.2.4雙熒光素酶報告基因分析 經在線軟件TargetScan Human7.2預測血清miR-27a及靶基因PPAR-γ的結合位點，采用Genecreate設計并構建報告基因 pmirGLO-PPARγ-3′UTR-WT、pmirGLO-PPARγ-3′UTR-MUT。熒光素酶試驗是采用雙熒光素酶報告分析系統(美國Promega公司)，根據產品說明執行。HEK293T細胞分別與miR-27a、 miR-NC、 ppmirGLO-PPARγ-3′UTR-WT、pmirGLO-PPARγ-3′UTR-MUT共轉染36 h。將細胞溶解并測量熒光素酶活性。

2 結 果

2.14組研究對象一般資料及生化指標水平比較 與對照組比較，CAD-T2DM組患者SBP、HbA1c、FBG、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C水平均明顯升高，HDL-C水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；4組其他一般資料和生化指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組研究對象一般資料及生化指標水平比較

組別nDBP(mm Hg)HbA1c(%)FBG(mg/dL)HOMA-IRTG(mmol/L)TC(mmol/L)對照組3678.44±5.605.42±0.4397.0(88.0,107.0)0.95±0.561.48±0.393.95±0.82T2DM組3881.61±8.957.95±1.03*189.0(156.0,239.2)*2.85±1.04*1.60±0.654.81±1.72*CAD組3682.36±11.275.54±0.35#97.5(82.7,109.5)#0.96±0.47#1.85±0.73*4.96±1.26*CAD-T2DM組3782.68±12.398.53±0.89*#△198.2(153.5,257.8)*△3.38±1.25*△2.34±1.01*#△5.74±1.63*#F/χ2/H1.389173.40847.25673.01210.0959.879P0.249<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與T2DM組比較，#P<0.05；與CAD組比較，△P<0.05。

2.24組研究對象血清miR-27a、PPAR-γ水平比較 與對照組比較，T2DM組、CAD組、CAD-T2DM組患者血清miR-27a表達水平降低，血清PPAR-γ水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與T2DM組、CAD組比較，CAD-T2DM組患者血清miR-27a表達水平進一步降低，血清PPAR-γ水平則進一步升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組血清miR-27a、PPAR-γ水平比較

2.3多因素Logistic回歸分析血清miR-27a與健康人群T2DM、CAD發生風險及T2DM患者CAD發生風險的相關性 分別以健康人群是否發生T2DM(賦值1=T2DM，0=對照組)、健康人群是否發生CAD(賦值1=CAD，0=對照組)、T2DM患者是否發生CAD(賦值1=CAD-T2DM，0=T2DM)作為因變量，校正各種混雜因素后，經多元線性回歸模型分析，血清miR-27a低表達水平可增加健康人群發生T2DM、CAD的風險或T2DM發生CAD的風險(OR=0.870、0.912、0.738，P<0.05)。見表3。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析血清miR-27a與及健康人群T2DM、CAD發生風險及T2DM患者CAD發生風險的相關性

2.4血清miR-27a表達水平對T2DM、CAD、CAD-T2DM的輔助診斷價值 經ROC曲線分析發現，血清miR-27a輔助診斷健康人群發生T2DM、CAD及T2DM發生CAD的AUC分別為0.755(95%CI：0.646～0.864，P<0.05)、0.759(95%CI：0.646～0.872，P<0.05)、0.850(95%CI：0.766～0.934，P<0.05)，cut off值分別為0.835、0.870、0.555，靈敏度分別為94.4%、88.9%、84.2%，特異度分別為44.7%、52.8%、70.3%。見圖1。

圖1 血清miR-27a用于輔助診斷T2DM、CAD、CAD-T2DM的ROC曲線

2.5血清miR-27a和PPAR-γ靶向調控關系 經TargetScan數據庫分析，miR-27a存在與PPAR-γ mRNA相結合的互補序列。經雙熒光素酶報告基因分析，miR-27a mimics和PPARγ-3′UTR-WT共轉染后，可降低熒光素酶活性(P<0.05)，但是與PPARγ-3′UTR-MUT共轉染后，熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。見圖2。

注：與miR-NC比較，*P<0.05。

2.6CAD-T2DM組患者血清miR-27a和PPAR-γ水平的關系 經Pearson分析發現，CAD-T2DM組患者miR-27a表達水平與血液PPAR-γ水平呈負相關(r=-0.808，P<0.05)。見圖3。

圖3 CAD-T2DM組患者血清miR-27a和PPAR-γ水平的關系

3 討 論

CAD是嚴重威脅人類健康和生命的心血管疾病，多發于40歲以上人群，受高血壓、高血脂和T2DM等多種因素影響[6]。流行病學調查結果顯示，我國CAD患者合并 T2DM呈逐年升高趨勢[7]。與單純T2DM或單純CAD患者比較，CAD-T2DM患者病情更加嚴重，且會出現彌漫性改變征象，因而具有較高的病死率和致殘率。及時采取有效的治療和控制措施，對CAD-T2DM患者有重要意義。

本研究結果顯示，與對照組、T2DM組和CAD組比較，CAD-T2DM組患者血清miR-27a表達水平明顯降低，而且經單因素和多因素Logistic回歸分析顯示，血清miR-27a低表達水平是增加健康人群發生T2DM、CAD及T2DM發生CAD的獨立危險因素。在ROC曲線分析中，血清miR-27a可以用來分析健康人群與CAD患者或T2DM患者及T2DM患者與CAD-T2DM患者之間的區別。經Pearson相關分析顯示，CAD-T2DM組患者血清miR-27a和PPAR-γ水平呈負相關。生物信息學和熒光素酶報告基因證明，miR-27a可以直接靶向PPAR-γ基因的3′UTR并介導其相關轉錄。上述研究數據表明，miR-27a與T2DM和CAD的發生均有關，可能是兩種疾病的共病機制之一，而且miR-27a與PPAR-γ基因存在靶向調控關系，miR-27a低表達可能是引起PPAR-γ表達上調的重要原因。

CAD合并T2DM的發生是環境與多種基因聯合作用進而影響相關通路活性改變的復雜疾病[8]。PPAR-γ基因位于3號染色體，其編碼的PPAR-γ是核激素受體家族成員之一，主要在脂肪組織、造血細胞和大腸中表達。PPAR-γ控制著大量基因的表達，這些基因涉及代謝穩態、脂質、葡萄糖和能量代謝、脂肪形成和炎癥等[9]。有研究證實，PPARs調節大量代謝通路，與代謝綜合征、T2DM、非酒精性脂肪肝和心血管疾病等代謝性疾病的發病機制有關[10]。例如PPAR-γ可通過減少基質金屬肽酶9的表達來降低斑塊的穩定性，并通過刺激氧化低密度脂蛋白的攝入來促進泡沫細胞形成，這也可能被PPAR-γ依賴或獨立的反調節機制所抵消[11]。QIAN等[12]研究發現，PPAR-γ基因外顯子中C161T的多態性可能會影響促炎細胞因子的分泌，并影響對CAD的易感性。HASAN等[13]研究證實，埃及人群中PPAR-γ基因rs1801282位點單核苷酸多態性可以增加T2DM發生CAD的風險。PPAR-γ可以將脂質和糖代謝的改變與CAD的發展聯系起來，尤其是在CAD合并T2DM中。有研究證實，PPAR-γ在CAD-T2DM患者血清中呈高表達，而通過PPAR-γ激動劑(如噻唑烷二酮類)誘導PPAR-γ活化后，導致PPAR-γ構象發生改變，血清PPAR-γ表達水平下降[14]。目前，很多人工合成的PPAR-γ 激動劑，如曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮被證實可以降低T2DM發生CAD的風險，并且能夠改善CAD-T2DM的預后，但是其具體調控機制有待進一步研究。

miRNA是一種內源性非編碼RNA，可以調控靶基因轉錄后翻譯過程，其中miR-27a被證實與胰島素抵抗及血脂代謝途徑有關。YU等[15]研究證實，miR-27a可能參與了糖尿病的病理機制，如脂質代謝紊亂、氧化應激、細胞外基質沉積、腎纖維化等。本研究結果顯示，與對照組、CAD組和T2DM組比較，CAD-T2DM組患者血清miR-27a水平明顯下降，這表明與冠狀動脈事件的風險呈負相關，該結果與之前的基礎研究結論基本一致。PPAR-γ為單亞基，具有N端區(A/B區)、居中高度保守的DNA結合區(C區)和C端的激素結合區(E區)。本研究通過TargetScan在線數據庫預測，PPAR-γ mRNA可能含有與miR-27a結合的靶向位點。通過雙熒光素酶報告基因分析，miR-27a mimics和PPARγ-3′UTR-WT共轉染后，可降低熒光素酶活性，說明miR-27a可以直接靶向PPARγ-3′UTR并介導相關轉錄。進一步通過Pearson相關分析顯示，在CAD-T2DM患者miR-27a和PPAR-γ之間存在明顯負相關，說明miR-27a低表達可能是影響PPAR-γ基因轉錄的重要上游機制之一。另外，ROC曲線分析顯示，血清miR-27a用于輔助診斷T2DM、CAD、CAD-T2DM發生的靈敏度較高，說明血清miR-27a不僅可以作為一項潛在的風險預測參數，而且還可以作為1項生物標志物來區分發生CAD的T2DM患者和未發生CAD的T2DM患者。本研究納入的樣本量相對較小，miR-27a用于鑒別的實用性還需要進一步確認。

綜上所述，CAD合并T2DM患者表現為血清miR-27a表達水平降低，這可能是導致血清PPAR-γ水平升高的重要原因之一。檢測血清miR-27a表達水平對于輔助診斷T2DM并發CAD有一定臨床價值，而且miR-27a和PPAR-γ也有望成為未來預防或治療CAD合并T2DM的新靶點。