大黃及單體對金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用及作用機制研究*

徐令清,莫艷梅,簡永歡，黎梓楠，何倩君,溫偉洪,湯英賢,劉加偉,劉麗忠

廣州醫科大學附屬第六醫院檢驗科/清遠市人民醫院檢驗科,廣東清遠 511518

金黃色葡萄球菌是臨床化膿性感染的重要病原菌之一，金黃色葡萄球菌是臨床感染中最為常見的致病菌，可導致皮膚膿腫、肺炎、心膜炎、化膿性關節炎及菌血癥等[1]。在細菌感染性疾病的治療中，抗菌藥物的應用一方面使許多嚴重的細菌感染性疾病得到有效控制；另一方面也使細菌的耐藥性增強，臨床上出現了大量多重耐藥菌株。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)具有致病力強、傳播速度快、常表現為多重耐藥等特點,其耐藥機制復雜，治療難度大，病死率高。MRSA對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥，并且對大環內酯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等抗菌藥物多數耐藥，導致抗MRSA感染藥物的品種選擇有限。因此，尋找新的抗MRSA的藥物顯得十分重要和迫切。相關報道顯示，大黃對金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強，大黃來源廣泛，價格低廉，含有多種活性成分，對人體不良反應小，不僅能抗菌消炎，而且對金黃色葡萄球菌不易產生耐藥性，這在臨床上有很大的價值[2]。因此，大黃具有研究和開發的潛力，有廣闊的應用前景，對改善多重耐藥菌感染性疾病的治療及有效對抗 MRSA 感染的藥物有重要臨床意義。

1 材料與方法

1.1菌株來源 選取廣州醫科大學附屬第六醫院(清遠市人民醫院)2019年檢驗科微生物室分離的80株金黃色葡萄球菌，包括MRSA 40株，甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)40株。標準菌株為金黃色葡萄球菌 ATCC 29213(微生物室保存菌株)。

1.2試劑與儀器 大黃(康美藥業股份有限公司)；大黃單體：大黃酸-8-0-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃酚、蘆薈大黃素、沒食子酸、大黃酸、大黃素和大黃素甲醚(成都曼斯特生物科技有限公司)；血平板(江門市凱林貿易有限公司)；肉湯培養基與M-H瓊脂平板(廣州市迪景生物科技有限公司)；二甲基亞楓(DMSO)(天津市富宇精細化工有限公司)；96孔板(北京欣興強森生物科技有限公司)；IFA-110T-8型微生物培養箱(藝思高科技有限公司)；DHP-9145A電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；DensiCHEK Plus電子比濁儀(生物梅里埃美國股份有限公司)；VITEK2 Compact全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)；uLtiMate 3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；DTT-A型電子天平(福州華志科學儀器有限公司)；酶標儀(德國BMG Spectrostar Namo全波長)。

1.3方法

1.3.1大黃混懸液和大黃單體溶液制備 稱取大黃5 g置于離心管中，加入無水乙醇30 mL，進行萃取48 h，再將萃取液過濾揮干后，用無菌蒸餾水配制成256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg/mL共12種質量濃度。將8種大黃單體用DMSO分別配制成128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25 mg/mL 共10種質量濃度。均置于4 ℃保存備用。

1.3.2菌液制備 將菌株接種于血平板，37 ℃培養18 h，抑菌試驗法(用生理鹽水配制成0.5麥氏濁度)；最小抑菌濃度(MIC)測定法(用肉湯培養基配制成0.5麥氏濁度)，菌液濃度均為1.5×108cfu/mL。

1.3.3高效液相檢測大黃組分 (1)樣品提取：取5個錐形瓶，稱取大黃各5 g置于5個錐形瓶中，分別加入丙酮、無菌蒸餾水、乙腈、甲醇和乙醇各100 mL，用封口膜把瓶口封好。超聲提取30 min，用0.22 μm有機膜濾膜過濾到樣品瓶中。(2)標準品溶液制備:分別精密稱取8種單體1 mg，置于8個滅菌EP管中，各加入1 mL 的乙醇進行溶解。(3)高效液相色譜法檢測：采用C18(5 μm，4.6 mm×250.0 mm)色譜柱，流速為1.0 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫35 ℃，進樣量2 μL。流動相為乙腈水(50∶50)。分別對提取溶液和標準品溶液進行檢測。

1.3.4大黃對3株金黃色葡萄球菌的抑菌作用 每種菌株取2個M-H瓊脂平板，用無菌棉簽蘸取0.5麥氏濁度菌液于平板上進行均勻涂布后，用無菌槍頭扎7個孔。將12種質量濃度的大黃混懸液各10 μL加在平板周圍6個孔中，平板中間孔加無菌蒸餾水作為對照。將平板置于37 ℃培養箱培養18 h。

1.3.5大黃8種單體對標準菌株的抑菌作用 每種單體取2個M-H瓊脂平板，用無菌棉簽蘸取菌液于平板上進行均勻涂布后，用槍頭扎6個孔。將10種質量濃度的大黃單體溶液各10 μL加在平板周圍6個孔中，平板中間孔加DMSO作為對照。將平板置于37 ℃培養箱培養18 h。

1.3.6大黃對80株金黃色葡萄球菌的MIC測定 于無菌96孔板中每孔加入肉湯菌液50 μL，第1個孔加入512 mg/mL大黃混懸液50 μL，采用微量倍比稀釋法，使大黃混懸液質量終濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg/mL共12種質量濃度。將96孔板置于37 ℃培養箱培養18 h。

1.3.7大黃8種單體對標準菌株的MIC測定 于無菌96孔板中每孔加入肉湯菌液45 μL后加入10種質量濃度的單體溶液各5 μL(單體質量終濃度分別為12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05和0.025 mg/mL)，取肉湯菌液45 μL+DMSO溶液5 μL作為陽性對照，肉湯培養基50 μL作為陰性對照。將96孔板置于37 ℃培養箱培養18 h。

1.3.880株金黃色葡萄球菌藥敏試驗 采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀，使用配套的鑒定卡和藥物敏感性卡進行細菌鑒定和藥敏試驗。

1.3.9標準菌株的生長曲線和DNA、RNA等大分子物質外滲水平檢測 取培養至對數生長期的標準菌株，用無菌生理鹽水配制成0.5 麥氏濁度，加入到含有大黃的肉湯培養基，使大黃質量終濃度為256 mg/mL。置于37 ℃培養箱培養。每隔2 h進行取樣，取樣時充分振蕩，用酶標儀檢測580 nm處的A值，以不加藥作為對照，繪制生長曲線。DNA、RNA等大分子物質的檢測每隔2 h進行取樣，4 500 r/min離心10 min后，吸取上清液，用酶標儀檢測260 nm處的A值，以不加藥作為對照，繪制曲線。

1.4統計學處理 采用Excel 2010進行數據處理。

2 結 果

2.1大黃組分的檢測結果 與標準品圖譜比對后發現，大黃用丙酮萃取的色譜圖出現5個色譜峰，表明有5種已知有效的成分被萃取出來。用無菌蒸餾水和乙腈萃取效果不明顯，用甲醇和乙醇萃取的色譜圖都出現9個色譜峰，表明都有9種已知有效成分被萃取出來，而且組分相似，由于甲醇有毒性作用，因此，選擇乙醇作為溶劑對大黃進行萃取。大黃單體中大黃酸-8-0-β-D-葡萄糖苷和沒食子酸的色譜圖都沒有出現色譜峰，可能是因為沒有完全溶解，影響檢測結果。大黃素-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素和大黃素甲醚都只出現一個色譜峰，說明溶解效果好，單體提取率高，大黃酸出現很相近的2個色譜峰，可能是同分異構體，說明純度不是很高。

2.2大黃對3株金黃色葡萄球菌的抑菌作用 從培養箱取出平板，測量抑菌圈直徑。大黃對3株金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑菌作用，大黃在質量濃度為8 mg/mL開始對標準菌株有抑菌作用，在質量濃度為32 mg/mL對MRSA和MSSA開始有抑菌作用。自32 mg/mL質量濃度起，大黃對MRSA的抑菌作用更明顯，抑菌圈直徑為19 mm。結果重復3次，取平均值。見表1。

表1 大黃對3株金黃色葡萄球菌的抑制圈直徑測定結果(mm)

2.3大黃8種單體對標準菌株的抑菌作用 從培養箱取出平板，用尺子測量抑菌圈直徑。8種單體中大黃酸-8-0-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃酚和大黃素甲醚對標準菌株沒有抑菌作用，而蘆薈大黃素、沒食子酸、大黃酸和大黃素對標準菌株均有不同程度的抑菌作用，其中大黃素對標準菌株的抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑最大，為20 mm,MIC為0.025 mg/mL。并且抑菌圈的直徑還與單體濃度呈正相關，濃度越高，抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好。結果重復3次，取平均值，見表2。

表2 大黃8種單體對標準菌株的抑制圈直徑測定結果(mm)

2.4大黃對80株金黃色葡萄球菌的MIC測定 大黃對40株MRSA 的最小抑菌濃度范圍為16～128 mg/mL，MIC 50為32 mg/mL，MIC 90為64 mg/mL；大黃對40株MSSA的最小抑菌濃度范圍為16～64 mg/mL，MIC 50為32 mg/mL，MIC 90為64 mg/mL。見表3、表4。

表3 大黃對80株金黃色葡萄球菌的MIC測定結果(株)

表4 大黃對40株MRSA和40株MSSA的MIC 50、MIC 90結果(mg/mL)

2.5大黃單體對標準菌株的MIC測定 經培養后，肉湯培養基澄清透明為無菌生長，混濁則為有菌生長，無菌生長的最低濃度稱為MIC。大黃單體對標準菌株均有不同程度的抑菌作用，其中大黃素對標準菌株的抑菌作用最強，MIC為0.025 mg/mL，大黃酸抑菌效果次之。見表5。

表5 8種單體對標準菌株MIC測定結果(mg/mL)

2.680株金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥情況 鑒定結果均為金黃色葡萄球菌，記錄80株金黃色葡萄球菌的藥物敏感性數據并計算耐藥率，40株MRSA抗菌藥物中青霉素、苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率均為100.0%，見表6；40株MSSA抗菌藥物中青霉素的耐藥率(90.0%)最高，見表7。

表6 40株MRSA對10種抗菌藥物的耐藥情況[n(%)]

表7 40株MSSA對11種抗菌藥物的耐藥情況[n(%)]

2.7標準菌株的生長曲線和DNA、RNA等大分子物質外滲濃度 標準菌株金黃色葡萄球菌經過一定時間的遲緩期，開始迅速生長，在12 h進入平緩期，從4 h開始，大黃作用組的A值始終明顯低于對照組，說明金黃色葡萄球菌生長明顯受到抑制，見圖1。大黃作用組的A值隨著作用時間而升高，且大黃作用組的A值始終高于對照組，說明大黃作用后的金黃色葡萄球菌中 DNA、RNA 等大分子物質大量外滲，使培養基中的核酸等大分子物質濃度升高,見圖2。

圖1 標準菌株金黃色葡萄球菌生長曲線

圖2 標準菌株的DNA、RNA等大分子物質外滲濃度檢測結果

3 討 論

金黃色葡萄球菌隸屬于葡萄球菌屬，常寄生于人和動物的皮膚、鼻腔、咽喉、腸胃、癰、化膿瘡口中，空氣、污水等環境中也無處不在，是最常見的醫院和社區獲得性致病菌之一，是僅次于沙門菌和副溶血桿菌的第三大微生物致病菌[3]，近年來暴發流行，抗菌治療方案有限，MRSA不僅對青霉素完全耐藥，而且對紅霉素、克林霉素、四環素均有很高(>70.0%)的耐藥率；對環丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、 慶大霉素、利福平的耐藥株也廣泛存在。多重耐藥菌株的出現使MRSA已經成為院內感染的重要病原體之一[4-5]。本研究結果顯示，在40株MRSA抗菌藥物中青霉素、苯唑西林、阿莫西林/克拉維酸的耐藥率均為100.0%，40株MSSA抗菌藥物中青霉素的耐藥率(90.0%)最高。近年來，眾多國內外學者嘗試從傳統醫學中尋找治療MRSA的新思路。有研究發現，多種中藥及其單體對MRSA 均具有良好的抑菌效果[6-10]。因此，尋找有效控制 MRSA 感染的藥物勢在必行。

大黃作為中國傳統中藥材，它在預防和控制細菌性感染疾病方面均發揮了積極作用。有研究表明，大黃具有較強的抗感染、抗衰老、抗氧化和增強免疫力等作用，它對多種革蘭陽性和陰性菌均有一定的抑菌作用，其中最敏感的是葡萄球菌和鏈球菌，抗菌譜廣[2]。大黃具備非特異性抗菌作用，并且能調節及提高機體免疫力，對細菌較難產生耐藥作用。在初篩試驗中，研究5種中藥(大黃、黃連、五味子、連翹、黃芩)對金黃色葡萄球菌的抑菌作用表明，大黃對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最好。因此，本研究將探討大黃不同成分對金黃色葡萄球菌的抑菌作用，初步研究大黃不同成分對金黃色葡萄球菌抑菌的機制，為解決臨床金葡萄球菌耐藥提供新的依據，并為中藥抑菌研究提供新的方向。

本研究選用了5種萃取溶劑(丙酮、無菌蒸餾水、乙腈、甲醇和乙醇)，這5種溶劑常用于大部分中藥進行萃取。通過高效液相色譜儀檢測，篩選出大黃的5種溶劑萃取物中組分較多的溶劑。5種溶劑中用無菌蒸餾水萃取的色譜圖沒有出現色譜峰，說明用無菌蒸餾水萃取效果較差。用丙酮和乙腈萃取的色譜圖出現色譜峰不多，說明萃取效果也不是很好。而甲醇和乙醇萃取出較多的色譜峰，說明萃取出的物質較多，而且組分相似，由于甲醇有毒性作用，因此，選擇乙醇作為溶劑對大黃進行萃取。本研究選用的大黃單體組分檢測中大黃素-8-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素和大黃素甲醚都只出現單個色譜峰，說明溶解效果好，單體純度較高。而大黃酸-8-0-β-D-葡萄糖苷和沒食子酸的色譜圖都沒有出現色譜峰，可能是因為沒有完全溶解，影響檢測結果。大黃酸色譜圖出現很相近的2個色譜峰，可能是同分異構體使用抑菌試驗平板法篩選出對標準菌株金黃色葡萄球菌抑制效果較強的大黃單體，結果表明，蘆薈大黃素、沒食子酸、大黃酸和大黃素對標準菌株均有不同程度的抑菌作用。其中大黃素對標準菌株的抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑最大，為20 mm，MIC為0.025 mg/mL。并且抑菌圈的直徑還與單體濃度呈正相關，濃度越高，抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好。

本研究通過抑菌試驗平板法研究大黃對3株金黃色葡萄球菌作用強弱，結果顯示，大黃對MRSA的抑菌作用較明顯。收集臨床分離的80株金黃色葡萄球菌，檢測大黃對80株臨床分離的金黃色葡萄球菌的MIC，均表現出一定程度的體外抑菌作用，MIC值范圍為16～128 mg/mL。本研究結果顯示，蘆薈大黃素、大黃素和大黃酸對金黃色葡萄球菌的抗菌效果較明顯，而這3種大黃單體均為蒽醌類化合物，說明大黃的有效成分可能為蒽醌衍生物[11]。

本研究通過對標準菌株金黃色葡萄球菌生長曲線的檢測說明大黃對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，DNA、RNA等大分子物質外滲濃度檢測證實大黃抑菌作用機制是能夠破壞金黃色葡萄球菌的細胞膜，導致菌體中DNA、RNA等大分子物質外滲，發揮抑菌作用。

周磊等[12]報道顯示，大黃素可抑制金黃色葡萄球菌物質代謝中的關鍵酶(琥珀酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶)的活性而發揮殺菌作用。曹峰[13]研究認為，大黃素抗MRSA 效果明顯，而且可破壞MRSA的細胞壁。劉明[14]研究認為，大黃素的抗菌機制與結合耐藥蛋白、抑制β-內酰胺酶活性、增加藥物在菌體內積聚無關。細菌的細胞膜是大黃素的作用部位，通過破壞細胞膜的完整性間接影響細胞壁合成，達到抗菌效果。

中藥抗菌具有較好的前景，它作用于抗菌的各個環節，可直接作用于微生物本身，如破壞細菌細胞壁和細胞膜的完整性改變細胞通透性、抑制菌體內酶的活性、影響細胞蛋白質核酸的合成、抑制細菌生物被膜的形成等機制。

本研究中大黃對金黃色葡萄球菌的抑菌作用明顯，這為臨床采用大黃治療由金黃色葡萄球菌引發的感染提供了依據，作用機制是通過破壞細菌細胞壁及細胞膜的完整性，關于其他的作用機制還有待進一步研究，以便更好地為臨床治療提供理論依據，將有助于在金黃色葡萄球菌感染中嘗試應用大黃進行治療，從而解決金黃色葡萄球菌的耐藥問題[15]。對傳統中藥進行抗菌藥物的發掘，將有助于發揮傳統中藥在臨床抗感染中的應用。本研究為大黃的抗菌作用進一步研究奠定了基礎，在細菌感染性疾病的治療中有重要意義。