SAMHD1在胃癌中的表達情況及其與預后的相關性

王 健 李雪薇 徐 鈞

(山西醫科大學第二醫院普外科，太原市 030001，電子郵箱：425505180@qq.com)

胃癌是起源于胃黏膜上皮組織的一種惡性腫瘤，發病率位居全球第二，全國第一[1]。尋找相關的腫瘤標志物對于制定胃癌個體化治療方案[2-4]、預后評估、術后復查等均有重大的臨床意義。不育α基序結構域和組氨酸/天冬氨酸殘基雙聯體結構域包涵蛋白1(sterile alpha motif and histidine/aspartic acid domain-containing protein 1，SAMHD1)是一種廣泛存在于髓核細胞中的抗病毒蛋白[5]，其可參與病毒復制的逆轉錄過程，調控脫氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)的水解進程，進而調控DNA復制，發揮抗病毒的作用[6]。近年來有研究顯示，SAMHD1在結直腸癌[7]、肺癌[8]、肝癌[9]、慢性淋巴細胞白血病[10]中存在基因突變現象，可導致SAMHD1表達明顯下調，是一種潛在抑癌基因，其內在機制可能與腫瘤細胞的基因突變、表觀遺傳學的改變有關。但目前尚未有關于SAMHD1在胃癌中作用的研究，而作為廣譜抗病毒和抗腫瘤蛋白，其可能在胃癌中也存在突變現象。本研究探討SAMHD1在胃癌組織中的表達及其與預后的相關性，為尋找胃癌患者的腫瘤標志物、治療靶點和判斷預后提供新方向。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年1月至2018年7月在山西省腫瘤醫院進行手術治療，術后病理明確診斷為胃癌的320例患者的手術標本。納入標準：初診即確診為胃癌的患者。排除標準：(1)術前接受過新輔助放化療治療的患者；(2)合并遠處臟器轉移的患者。其中男性260例，女性60例；年齡≤60歲196例，>60歲124例；腫瘤部位：胃竇部100例，賁門部155例，胃體部65例；病理分期參照2016年10月國際抗癌聯盟和美國腫瘤聯合會頒布的第八版胃癌原發腫瘤-區域淋巴結-遠處轉移(tumor-node-metastasis，TNM)分期系統[11]：Ⅰ期47例，Ⅱ期79例，Ⅲ期182例，Ⅳ期12例。本研究通過山西省腫瘤醫院醫學倫理委員會審批，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 SAMHD1多克隆抗體(生產批號：GR163628-2)購自杭州以恒生物科技有限公司，二抗酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物、磷酸緩沖鹽溶液、二氨基聯苯胺顯色劑、免疫組化抗原修復緩沖液(統一生產編號：G24958)購自羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.3 免疫組化試驗方法 將胃癌組織經甲醛固定后，石蠟包埋，切片，厚度約4 μm。對組織切片進行常規脫蠟、水化，采用過氧化氫去離子水孵育，阻斷內源性過氧化物酶的干擾。將脫蠟后的石蠟切片置于切片架上，加入免疫組化抗原修復緩沖液(高pH，50×)，確保組織完全浸沒在溶液中，然后采用高壓法進行抗原修復，加熱10 min后自然冷卻20 min，確保抗原充分修復。隨后用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次。取出切片，將3%過氧化氫與組織避光孵育15 min后，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，3 min/次。然后滴加50 μL 兔抗SAMHD1多克隆抗體工作液于組織上，4℃冰箱孵育過夜。一抗孵育完畢，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗切片3次，3 min/次。再滴加50 μL二抗于組織上，室溫孵育20 min；孵育完畢，將切片置入磷酸緩沖鹽溶液中沖洗3次，3 min/次，取出切片。同時配置DAB工作液，按每毫升顯色緩沖液(B液)中加入DAB顯色劑(A液)約40 mL的比例配置免疫顯色試劑，混勻后，滴加配好的DAB工作液50 μL于切片上，室溫孵育5 min顯色。顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色。最后用蘇木素復染，各級乙醇(70%～100%)脫水，每級3 min。取出切片置于二甲苯5 min，用中性樹膠封片。

1.4 免疫組化結果判讀 細胞膜或細胞質內觀察到棕黃色顆粒定義為陽性。選取染色均勻的陽性表達區域，統計5個高倍視野下陽性細胞的計數及染色強度。按陽性細胞率，陽性細胞率<5%為0分，6%～30%為1分，31%～70%為2分，>70%為3分；按著色強度分為不著色、淡黃色、深黃色，分別計0、1、2分。將陽性細胞率計分和著色強度計分相加，最終得分0分為陰性(-)，得分1～2分為弱陽性(+)，得分3～4分為陽性(++)，得分5分為強陽性(+++)。SAMHD1表達陽性包括陽性和強陽性。所有判讀結果均由兩名及以上臨床病理醫師負責判讀，當出現不同的判讀結果時，由兩名醫師協商確認判讀結果。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計數資料以例數和百分比表示，比較采用χ2檢驗；采用Cox風險模型分析患者預后的影響因素；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用log-rank 法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SAMHD1在胃癌組織中的表達情況 免疫組化分析結果顯示，SAMHD1在胃癌組織中的陽性表達率高達75.9%(243/320)，見表1、圖1。

表1 SAMHD1在胃癌組織中的表達情況

圖1 免疫組化分析結果

2.2 SAMHD1表達與臨床病理特征的關系 SAMHD1的表達情況與患者的性別和腫瘤原發部位無相關關系(均P>0.05)，但與患者的年齡和臨床分期相關(均P<0.05)，見表2。

表2 SAMHD1表達與臨床病理特征的關系(n)

2.3 SAMHD1表達與預后的關系 對320例患者進行隨訪，總體生存時間為手術開始至死亡或隨訪結束(截止日期2020年7月)，平均隨訪時間53個月，中位隨訪時間為65個月。以胃癌術后患者的生存時間作為因變量，以臨床上認為對患者的預后有影響的變量(性別、年齡、腫瘤臨床分期、SAMNHD1表達情況、腫瘤原發部位)作為自變量，采用Cox比例風險回歸模型進行單因素分析，變量賦值情況見表3。結果顯示，SAMHD1表達情況、年齡、臨床分期、腫瘤原發部位是胃癌患者預后的影響因素(均P<0.05)，見表4。將上述單因素分析中具有統計學意義的變量作為協變量，納入Cox比例風險回歸模型中進行多因素預后分析，結果顯示SAMHD1表達情況和臨床分期均是胃癌患者預后的獨立影響因素(均P<0.05)，見表5。

表3 變量賦值情況

表4 影響胃癌患者預后的單因素Cox 比例風險模型分析

表5 影響胃癌患者預后的多因素Cox比例風險模型分析

2.4 SAMHD1表達陽性患者和表達陰性患者預后的比較 Kaplan-Meier分析結果顯示，SAMHD1表達陽性患者的中位生存期為61個月，高于SAMHD1表達陰性患者的中位生存期25個月(χ2=9.147，P=0.002)，生存曲線見圖2。

圖2 SAMHD1表達陽性和表達陰性患者的生存曲線比較

3 討 論

胃癌是來源于胃黏膜上皮細胞的一種惡性消化道腫瘤，新發病例數逐年升高[12]。早期胃癌的臨床表現無特異性，常以上腹部不適、噯氣、呃逆等為先導癥狀，容易與胃的良性疾病混淆，使早期胃癌的診斷率下降。由于進展期胃癌死亡率高，5年生存率低于30%，且手術風險大，醫療資源消耗大，因此需要尋找合適的篩查、評估預后的手段[13]。SAMHD1是近年來新發現的一種天然廣譜抗病毒基因產物，隨著對SAMHD1基因研究的深入，人們發現SAMHD1基因在多種腫瘤疾病中存在不同程度的變異，導致SAMHD1異常表達。在衰老導致的老年肺癌患者中，SAMHD1出現低表達現象[8]，而同樣的現象也在肝癌[9]中被證實。研究發現，SAMHD1可通過調控p27來抑制周期蛋白依賴性激酶的活性，使早期腫瘤細胞比例與高表達的p27和SAMHD1水平呈正相關[9]。因此，SAMHD1可能是一種潛在的抗腫瘤蛋白，本研究探討其在胃癌組織中的表達及其與胃癌患者臨床特征的關系，為胃癌的診斷、治療、發病機制研究提供參考。

本研究中，胃癌組織SAMHD1陽性表達率高達75.9%，且SAMHD1的表達與患者的年齡、臨床分期相關(均P<0.05)。Cox比例風險模型分析結果顯示，SAMHD1表達和臨床分期均是胃癌患者預后的獨立影響因素(均P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析結果提示，SAMHD1表達陽性的胃癌患者的生存期長于SAMHD1表達陰性患者(P<0.05)。以上結果提示，SAMHD1表達陽性是胃癌患者預后的獨立保護因素，其獨特的抗病毒、調控細胞周期作用，可能也在惡性腫瘤組織中發揮作用。對結直腸癌患者進行研究發現[7]，SAMHD1基因在腸癌中的突變降低了SAMHD1在腫瘤組織中的表達，導致脫氧核糖核苷三磷酸酶不同程度的活性降低，導致dNTP生物降解程度變慢，破壞原有的dNTP池平衡，為腫瘤細胞DNA復制提供充足的dNTP，說明低表達的SAMHDA1是結直腸癌腫瘤生長的促進因素。結合本研究結果，SAMHD1在胃癌腫瘤細胞的生長過程中發揮著與脫氧核糖核苷三磷酸酶相似的作用，可以更好地穩定dNTP池[14]，調控DNA復制的底物濃度[15]，限制腫瘤的生長，進而發揮抗腫瘤作用，影響胃癌患者的預后。另外，SAMHD1可以調控長散布元件基因的表達下游產物開放閱讀框蛋白(open reading frame 2 protein，ORF2p)[16]。ORF2p的主要作用是調控DNA的反轉錄過程，然而，受到SAMHD1影響后，ORF2p在腫瘤細胞中表達下降，從而抑制逆轉錄轉座子的活性，延緩DNA反轉錄的過程，進而減緩細胞周期，影響腫瘤細胞的生長[17]，這可能是SAMHD1影響腫瘤患者預后的機制之一，但SAMHD1在胃癌發病中的內在機制還需要進一步研究。

綜上所述，胃癌組織中的SAMHD1廣泛表達，且其與部分臨床病理特征相關，SAMHD1表達陽性是胃癌患者預后的獨立保護因素。SAMHD1作為一個在多種腫瘤中存在廣泛突變的基因，對其進行深入研究，有助于探討腫瘤內在的發生和發展機制，為早期胃癌的診斷、預后判斷提供依據。