銅綠假單胞菌基因分子分型技術的研究進展▲

藍如束 羅 丹 何本進 黃盼柳

(1 廣西壯族自治區江濱醫院檢驗科，南寧市 530021，電子郵箱：gxlrshu@163.com；2 廣西中醫藥大學公共衛生與管理學院生物統計學教研室，南寧市 530200)

【提要】 銅綠假單胞菌是醫院常見的條件致病菌，同時也是造成院內感染的重要病原菌，可引起多種疾病，嚴重感染時可危及患者生命。基因分子分型技術是追蹤感染源及分子流行病學分析的重要手段，對于控制醫院內感染、確定流行菌株具有重要意義。本文就銅綠假單胞菌基因分子分型技術的研究進展進行綜述。

銅綠假單胞菌是一種非發酵的革蘭氏陰性桿菌，也是常見的條件致病菌，其致病性較強，可引起多種疾病，如囊性纖維化、肺炎、尿路感染、外耳炎、傷口感染、骨和關節感染、菌血癥和全身性感染等，嚴重感染時可危及患者生命[1-3]。國際醫院感染控制聯盟對全世界703個重癥監護病房進行了監測，發現銅綠假單胞菌是引起院內感染的最主要病原菌，其次是鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯氏菌[4]。全國細菌耐藥監測報告顯示，在臨床分離的細菌中，銅綠假單胞菌分離數量排名第四(8.76%)[5]。由此可見，銅綠假單胞菌的感染是不容忽視的問題。近年來，耐多藥和廣泛耐藥銅綠假單胞菌的出現，給臨床治療帶來很大的困難，同時也成為全球公共衛生問題[6]。隨著分子分型技術的快速發展，臨床上分子分型技術可用于銅綠假單胞菌的分子分型和同源性分析，對于判斷感染來源、切斷傳播途徑、控制感染蔓延具有非常重要的意義。本文就目前銅綠假單胞菌分子分型技術的研究進展進行綜述。

1 隨機擴增多態性DNA

隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是由美國科學家Williams等[7]在1990年發明的一種基因分型方法，是基于PCR技術的一種分子生物學方法，可對未知基因組序列的物種進行多態性分析。該方法以DNA單一引物為模板，通過PCR擴增后經凝膠電泳獲得非特異性條帶，若條帶相同則可判斷為同源菌株[7]。RAPD具有穩定性較好，分辨率高，不需明確基因組序列即可進行分型，對DNA模板要求質量不高，操作簡單等優點。但也存在重復性稍差，不同實驗室間的結果以及流行菌株特征難以比較的缺點[8]。該方法廣泛應用于追蹤醫院院內感染傳染源和疫情處置。Trautmann等[9]利用RAPD檢測重癥監護病房患者病灶和自來水中銅綠假單胞菌的基因，發現有50%的銅綠假單胞菌有相同基因，認為病房的自來水可能是引起患者銅綠假單胞菌感染的主要原因。有學者[8]通過RAPD發現銅綠假單胞菌常見基因型對抗生素的耐藥程度和毒力較強，耐藥菌株易發生醫院院內感染[10]。

2 多位點序列分型

多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是于1998年提出的一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，該方法是在多位點酶電泳法的基礎上發展而來。MLST通過PCR擴增菌株的多個管家基因(每株菌株通常有七個或多個管家基因)，并對擴增產物進行測序，將測序數據上傳至PubMLST數據庫進行序列比對，鑒定菌株的等位基因型與序列類型，通過比較序列類型來判斷菌株是否具有同源性，以此對細菌進行分型[11-12]。銅綠假單胞菌有acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE等7個管家基因[13]，其基因引物序列可在PubMLST數據庫獲取。MLST具有較強的種內分辨率，結果重復性好，在不同的實驗室間有良好的可比性[14]。Gomila等[15]應用MLST對銅綠假單胞菌的遺傳多樣性進行分析，認為該方法可作為院內感染或疫情暴發的調查手段。Blanc等[16]應用全基因組測序與MLST兩種方法對銅綠假單胞菌進行分子流行病學研究，結果顯示兩種方法的同源性分辨率相同。MLST的缺點是操作過程所需的儀器特殊、成本高、費時等，從而限制了其在醫院的推廣普及[17]。

3 腸桿菌基因間重復共有序列PCR

腸桿菌基因間重復共有序列PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence PCR,ERIC-PCR)是一種基于PCR的擴增技術，其通過對細菌高度保守重復序列進行擴增，依據擴增條帶的位置和數量來判斷是否為同一基因型[18]。銅綠假單胞菌擴增引物序列為：上游引物5′-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-3′，下游引物5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′[19]。ERIC-PCR法的優點是成本低，操作簡單，具有良好的分辨率[20]；同時也存在以下局限性：基因組重復序列有可能出現突變、缺失等情況，造成擴增無條帶現象；其次PCR產物的長度不能確定,可導致電泳條帶出現顯像模糊、缺失的現象[21]，影響結果的判斷。臨床上常用ERIC-PCR來判斷菌株的同源性。Zarei等[22]應用該方法調查醫院重癥監護病房環境、住院患者和病房蟑螂的銅綠假單胞菌，共分離到109株銅綠假單胞菌，經ERIC-PCR法分析，結果顯示，不同來源銅綠假單胞菌的分離株之間存在14個不同的基因組重復序列指紋圖譜，表明住院患者、重癥監護病房環境和病房蟑螂的分離株具有同源性關系。盧雯君等[23]對重癥監護室分離到的112株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌進行同源性分析，發現可將112株菌株分為5個基因型，菌株間呈高度同源性，認為病房內存在互相傳播的可能。

4 脈沖場凝膠電泳

脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是利用周期性交替變換電場方向分離大片段DNA的一種方法，在脈沖場凝膠電泳作用下，可有效分離10 kb至10 Mb大小片段的DNA分子，相近和相似的物種DNA分子將出現相似的圖譜，以此判斷其同源性[24]。標本電泳前需利用限制性內切酶將物種DNA分子消化分解成大小不一的片段；選擇限制性內切酶時，對于已測序的基因組DNA，要求其具有相應的識別位點，但如果基因組DNA尚未測序，則可以根據生物體的G+C含量來選擇限制性內切酶；銅綠假單胞菌常用的限制性內切酶為SpeⅠ或XbaⅠ[25]。因PFGE的分辨率高，可以對菌株大部分基因組(>90%)進行同源性分析,且不需要合成引物，其已成為醫院感染暴發調查中分子流行病學研究的重要手段，也被譽為細菌分子分型的“金標準”[26]。但PFGE操作復雜、費時長(約2～3 d),且需要配備專業設備和操作熟練的檢測人員；此外，其還存在電泳結果的影響因素較多(如電泳的電壓和時間、電泳液的濃度和溫度等)和重復性較差等缺點[27-28]。該方法常用于病原菌的同源性分析，對疫情處置和控制醫院院內感染起到重要作用，同時還可用于監測土壤或水中的微生物。

5 多位點可變數目串聯重復序列分析

多位點可變數目串聯重復序列分析(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA)是一種基于PCR檢測數目可變串聯重復序列的基因分型方法[29-30]，原理是通過PCR擴增串聯重復區并測量擴增產物的大小，再通過凝膠電泳或高分辨率毛細管電泳確定每個位點的重復數，根據重復數區分等位基因，利用MLVABank公共數據庫(http://mlva.i2bc.paris-saclay.fr/mlvav4/genotyping/)進行微生物基因分型，可以利用來自多個重復區域的一組等位基因對克隆群進行鑒定[29]。由于其操作簡單、檢測通量大、不需要配備特殊儀器、成本低、結果重復性好、分辨率高、在不同的實驗室之間可相互比較等優點，已廣泛應用于多種細菌的分子分型和溯源性追蹤[31]。隨著該技術越來越完善，MLVA已成為醫院流行病學調查中主流的克隆性基因分型方法[32]。但缺點是一株菌株需要對多個位點進行擴增，存在檢測工作量大等不足。

6 基于PCR的開放閱讀框分型

基于PCR的開放閱讀框分型(PCR-based open-reading frame typing,POT)是一種基于多重PCR技術檢測多個開放閱讀框(open-reading frame,ORF)分布情況的方法，其通過凝膠電泳來判斷每個ORF是否缺失，結果以數據1和0的格式顯示，通過十進制換算成POT數值[33]。銅綠假單胞菌是通過檢測10個小基因島ORF和7個基因島ORF計算得到每株菌株的POT數值，POT數值相同的菌株可判斷為具有同源性[34]。該方法具有操作簡便、費用低、重復性好、檢測時間短(約4 h)、實驗室間的結果易于對比、設備需求簡單(只需要普通PCR儀器和瓊脂糖凝膠電泳設備)等優點，可以作為許多國家和地區普通臨床微生物實驗室的常規分子流行病學分析和鑒定細菌遺傳譜系的方法[33]。但與PFGE和MLST相比，POT的分辨率略低[34]。Suzuki等[34]將POT應用于銅綠假單胞菌基因分型，通過對不同銅綠假單胞菌(PAO1、PA7、UCBPP-PA14和LESB58)全基因組序列的比較，篩選出17個ORF作為銅綠假單胞菌的標志物。

7 全基因組測序單核苷酸多態性分型

全基因組測序技術是通過對病原菌基因組進行測序，以獲得有關病原菌檢測、鑒定、分型和藥物敏感性等信息[35]。全基因組測序的檢測過程比較復雜，需要配備特殊儀器和軟件，對檢測人員能力要求較高[36]。近年來,隨著測序技術的飛速發展，測試通量增加及成本的降低,該技術被廣泛應用于臨床和流行病學調查中[37]。全基因組測序的明顯優勢是在單次運行中可產生數百萬個讀數,然后通過專用處理軟件進行組裝,最終構建菌株基因組的完整核苷酸序列,其具有靈敏度和特異度較高、能夠及時發現病原菌變異和新的病原體等優點[38]。但全基因組測序也存在以下的局限性[36,39]：不能檢測標本中所有微生物，標本中含有低濃度微生物和難破壁的微生物時易出現漏檢；不能分析特定耐藥基因或毒力基因；數據處理及其分析需要具有生物信息學分析能力的技術人員等。

8 小 結

由于不規范使用抗菌藥物而導致院內感染的情況時有發生，但目前細菌表型分型和分子分型技術均存在不足，因此未能滿足臨床應用。隨著分子分型技術的快速發展，臨床上迫切需要一種操作簡便、分辨率高、重復性好、費用低、不同實驗室間結果有可比性的分型方法。近年來，高通量全基因組二代測序在臨床上普及應用，測序成本越來越低，全基因組測序分型將有望替代目前已有的分型方法。各醫療單位應該結合自身技術條件選擇適當的分型方法確定感染源和傳播途徑，及時采取防控措施，減少感染的發生。