浙江省漿蜂種蜂場蜜蜂病蟲害檢測分析

馬敏彪，施金虎，王 帥，鄭火青

(1.浙江省畜牧技術推廣與種畜禽監測總站，浙江 杭州 310021； 2.浙江大學動物科學學院)

1 養蜂概況

養蜂業是浙江省的一個特色產業，在促進農民增收、農業發展和鄉村振興中發揮重要作用，漿蜂養殖量和蜂產業總產值一直穩居全國第一[1]。浙江省現有飼養蜂群140萬群，其中漿蜂(西方蜜蜂)100萬群，中華蜜蜂40萬群[1]。

相比于本土的中華蜜蜂，漿蜂生產力更強，產品種類更加豐富，產業鏈更加完整[2]。雖然意蜂生產力較優，但其在飼養過程中也面臨更嚴峻的病蟲害威脅[3]。因此，蜂種的抗病力直接決定了蜂群的健康程度，進而影響其生產力和蜂場的經濟效益。目前，意蜂上常見的病蟲害包括蜂螨、微孢子蟲等寄生蟲以及病毒等病原體[4-5]，它們間的協同作用也被認為是近年來世界范圍內蜂群大量損失的誘發因子[6-7]，引起了行業的廣泛關注。

蜂螨，主要為狄斯瓦螨(俗稱大蜂螨)，是蜜蜂的一種體外寄生螨，主要以吸食蜜蜂體液為生，不僅直接對蜜蜂生理造成損害，縮減蜜蜂壽命，而其作為多種病原的載體，與其他病原(如病毒和微孢子蟲)間的協同作用更是影響了整個蜂群的健康[3,6-7]。微孢子蟲作為蜜蜂腸道的專性寄生蟲，對蜜蜂消化系統影響顯著，其也會與蜂螨和病毒產生協同作用從而降低蜂群的健康態勢[6]。目前，已經報道和確認的蜜蜂病毒超過30種[8]，而其中國內常見的蜜蜂病毒主要有黑蜂王臺病毒(Black queen cell virus, BQCV)、慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus, CBPV)、殘翅病毒(Deformed wing virus, DWV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)和囊狀幼蟲病毒(Sacbrood virus, SBV)等5種[9]，且多數以隱性感染的狀態存在，直到有其他誘發因子(如寄生蟲感染)造成顯性癥狀[10]。本文通過對浙江省內主要6家漿蜂種蜂場蜜蜂對蜂螨(本文主要指狄斯瓦螨)、微孢子蟲和5種常見病毒等抗病力指標的測定，以期為漿蜂種質資源的管理和利用提供參考，并為后續的蜜蜂相關育種以及蜜蜂病蟲害防控等工作提供一定的借鑒。

2 材料與方法

2.1測試蜂群 從蕭山、淳安、長興、紹興、蘭溪、江山等6縣市6家種蜂場，每家蜂場選取群勢相近的5個蜂群作為測試蜂群，于2019年9月18日運到位于杭州市臨安區的浙江省種畜禽質量檢測中心。測試蜂群到達后統一換用提前準備的新箱，隨機交替放置在測試場地，并編號，由專人統一負責飼養管理。

2.2測定指標 分別于2019年12月13日和2020年3月11日對每個蜂群取樣進行抗病力測定，測定指標包括蜂螨寄生率、微孢子蟲孢子數和主要病毒感染率和感染滴度。

2.2.1蜂螨寄生率 從每個蜂群的隔板和外側巢脾上分別取50只成年蜜蜂工蜂，冷凍麻痹后檢查每只蜜蜂體上的蜂螨個數，計算所檢查到的蜂螨總數與檢查蜜蜂總數的百分比分別獲得兩個取樣點的蜂螨寄生率，兩個取樣點的值取平均后得到該群蜜蜂的蜂螨寄生率。同時為了保證蜂群安全越冬，在越冬期間對每個蜂群均進行治螨處理。同時檢測蜂群在越冬期的治螨效果，在越冬期間對每個蜂群均進行治螨處理。

2.2.2微孢子蟲孢子數 從每個蜂群的隔板和外側巢脾上分別取15只成年蜜蜂工蜂，剪下30只蜜蜂的腹部，加入30 mL純凈水，充分研磨；充分混勻后吸取10 μL研磨液滴于血球計數板中間，在10×40倍顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)下進行微孢子蟲孢子計數，每個蜂群重復3次，最后取平均值計算出各蜂群內平均每只蜜蜂體內的微孢子蟲孢子數。

2.2.3病毒感染率和感染滴度 從每個蜂群的隔板和外側巢脾上各取15只成年蜜蜂工蜂，每群共30只蜜蜂，用液氮冷凍后充分研磨，取100 mg的粉末通過RNA提取試劑盒(Aidlab, Beijing, China)進行總RNA提取，經ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix反轉錄試劑盒(TOYOBO, Osaka, Japan)得到cDNA，最后利用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix熒光定量PCR試劑(TOYOBO, Osaka, Japan)檢測蜜蜂常見的5種病毒(BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV)的感染率和感染滴度。病毒的絕對定量采用浙江大學蜂學實驗室根據早先相應病毒構建質粒所獲得的標準曲線，公式分別如下：YBQCV=-3.1935X+38.743,R2=0.9971；YCBPV=-3.3271X+45.973,R2=0.9907；YDWV=-3.3213X+40.914,R2=0.9997；YIAPV=-3.2646X+38.918,R2=0.9955；YSBV=-3.3639X+48.458,R2=0.9938(其中Y為檢測得到的CT值，X為病毒的log拷貝數，10Xcopies為病毒感染滴度)。

2.3統計分析 對本研究中蜂群成蜂數量、子脾數量、微孢子蟲孢子數和病毒感染滴度通過單因素方差分析(one-way ANOVA)來進行統計分析，并選用單因素方差分析中的Tukey法進行多重比較。對蜂螨侵染率和病毒感染率采用卡方檢驗(Chi-square test)進行分析。統計分析均使用SPSS 20.0軟件(IBM, Armonk, USA)進行，且當P值小于0.05時即認為差異顯著。

3 檢測結果

3.1蜂群進場時基本情況 測試蜂群進場當天的基本情況見表1。30個蜂群除蕭山種蜂場的4個蜂群有11張巢脾外，其余所有蜂群均為10張巢脾。每群的蜂量和子脾數在不同蜂場間差異較大，蕭山、蘭溪、紹興、長興蜂場，蜂群巢脾基本相稱，其中蕭山蜂場因巢脾數更多，蜂量和子脾數都明顯多于其它蜂場；淳安蜂場蜂群略少于脾；而江山蜂場蜂量明顯不足，子脾數也明顯少于其它蜂場的蜂群。

總體而言，各蜂場內部蜂群之間在成蜂數量和子脾數上無顯著差異(P>0.05)，而在進場時，蜂場間無論是成蜂數量(P<0.001)還是子脾數量(P<0.001)上差異均顯著，等到越冬期和春繁期時，各蜂場間蜂群群勢已無明顯區別(圖1)。

表1 測試蜂群進場時的基本情況

圖1 不同時間段各地區種蜂場的成蜂量(A)和子脾數(B)情況

3.2蜂螨寄生率 越冬期(2019年12月)各蜂場蜂群蜜蜂通過取成年蜂檢查蜂螨數量，計算得到蜂螨寄生率在3.68%-8.67%之間，其中，長興蜂場的平均蜂螨寄生率要高于其它蜂場，但差異不顯著(P>0.05，圖2)。因在越冬期間蜂群治螨比較徹底，而在3月份取樣前，蜂螨數量還未有明顯增加，在2020年3月取樣的所有蜂群的成年蜂體表均未檢查到蜂螨，即所有蜂群的蜂螨寄生率均為零。

圖2 各蜂場蜂群蜜蜂的蜂螨寄生率

3.3微孢子蟲感染情況 在越冬期(2019年12月)，所有蜂群的微孢子蟲孢子數在0-7.0×105個/蜂之間。長興蜂場的5群蜜蜂均沒有觀察到微孢子蟲感染；蕭山蜂場每群蜜蜂的微孢子蟲感染情況都比較嚴重，平均每只蜜蜂體內孢子數達到2.7×105個，顯著高于其它蜂場的蜂群(P<0.05)；其余蜂場的蜜蜂體內僅有少量孢子(圖3)。而在春季(2020年3月)所有蜂群的微孢子蟲孢子數在0-2.3×106個/蜂之間。其中，除了蕭山蜂場以外，其它5個蜂場蜜蜂體內微孢子蟲數量均有不同程度的上升，尤其是紹興蜂場平均每只蜜蜂體內孢子數從越冬期的0.2×105個顯著上升到春繁期的9.1×105個，顯著高于淳安(P<0.05)和蕭山(P<0.05)蜂場的蜂群，而其它蜂場間有沒有顯著區別(P>0.05，圖3)。

圖3 各種蜂場蜜蜂體內微孢子蟲孢子數注：不同字母之間代表差異顯著。

3.4病毒感染情況

3.4.1病毒感染率 越冬期(2019年12月)和春繁期(2020年3月)各個種蜂場蜜蜂體內常見的5種蜜蜂病毒(BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV)的感染率如圖4所示。在越冬期，各個蜂場均有很高比例的蜂群感染BQCV(60%～100%)、CBPV(80%～100%)和DWV(100%)，而IAPV(20%～80%)和SBV(0～20%)感染比例相對較低。從越冬期到春繁期，整體而言，除了BQCV以外，各個蜂場蜜蜂體內其它4種病毒的感染率呈現一定的下降趨勢。其中，在春繁期(2020年3月)，江山蜂場蜜蜂體內IAPV感染率(60%)顯著高于千島湖蜂場(0%，P<0.05)，長興蜂場蜜蜂體內DWV感染率(100%)顯著高于紹興蜂場(40%，P<0.05)。除此之外，其它各組病毒感染率在越冬期和春繁期并沒有顯著變化(P>0.05，圖4)。

圖4 不同取樣時間點各種蜂場蜜蜂體內常見病毒感染率注：*代表P<0.05。

圖5 不同取樣時間點各種蜂場蜜蜂體內常見病毒感染滴度注：不同字母代表不同的顯著性水平。

3.4.2病毒感染滴度 對于6家種蜂場蜜蜂體內五種常見病毒感染滴度的測定結果如圖5所示。在越冬期(12月13日)，各蜂場蜜蜂體內只有SBV病毒感染滴度存在顯著差異，即沒有SBV感染的蕭山蜂場蜜蜂顯著低于其他5家蜂場(均為P<0.001)，蘭溪蜂場蜜蜂體內SBV病毒感染滴度也要比淳安(P<0.05)和紹興(P<0.01)兩家蜂場明顯更高。而到春繁期(3月11日)，除了江山蜂場蜜蜂體內SBV感染滴度明顯較高以外，其他5家蜂場蜜蜂體內的病毒感染滴度已不可檢測到，此時，千島湖蜂場蜜蜂體內IAPV病毒感染滴度也低于檢測限，顯著低于其他幾家蜂場(均為P<0.01)。除此之外，其他病毒的感染滴度在不同時間段內各蜂場間無明顯區別(P>0.05，圖5)。

總體而言，平均每群蜜蜂體內CBPV病毒感染滴度在3.99-6.19(基因組log拷貝數，下同)之間，并且病毒感染滴度在越冬期和春季產蜜期之間也無明顯區別。對于BQCV，平均每群蜜蜂體內病毒感染滴度從越冬期(2.81-3.67)到春繁期(5.17-6.69)顯著上升(P<0.001)；而相反地，DWV病毒感染滴度(6.96-8.09)從越冬期到春繁期則呈現顯著下降趨勢(P<0.001)。此外，和DWV類似，從越冬期到春繁期IAPV(越冬期：2.63-3.29；春繁期： 0.00-1.66，P<0.001)和SBV(越冬期：0.00-6.98，春繁期：0.00-5.47，P<0.001)的病毒感染滴度也均有明顯的下降趨勢(圖5)。

4 討論

蜜蜂作為社會性昆蟲，蜂群整體健康狀態與外界環境息息相關，所以在做相關測定時，必須選擇一個適宜的地方進行集中測定。本次對蜜蜂抗病力指標的集中測定是近年來全國首次對蜜蜂種質進行的集中對比研究。目前的結果表明6家種蜂場的蜜蜂在微孢子蟲和病毒感染等抗病力指標上存在顯著差異，而對于蜂螨的寄生并無明顯區別。

雖然在進場時，6個蜂場間的蜂群群勢差異較大，但在越冬期和春繁期時蜂群在蜂量和子脾數量上趨同(圖1)，說明養蜂生產上的飼養管理能對蜂群群勢起到決定作用。這也為后續相關抗病力指標的測定提供了參考，由此避免了蜂群群勢差異可能對本研究造成的一定影響。

漿蜂蜂螨寄生率主要和蜂群本身的抗螨性及蜂場治螨效果有關。目前浙江省的漿蜂蜂群都不是抗螨蜂種，本次的測定結果也表明不同時期不同種蜂場的蜂群在蜂螨寄生率上無顯著差異，顯示各蜂場蜜蜂的抗螨能力類似。在蜂種無抗螨性的情況下，蜂群的蜂螨寄生率基本取決于蜂場的治螨效果。在越冬期測得各蜂群的蜂螨寄生率在0-19.44%之間，說明總體來看該時期蜂場治螨效果較佳，但仍有少數蜂群蜂螨寄生率超過了10%，蜂群健康處于明顯受威脅的狀態，這一點和越冬期間部分蜂群出現死蜂的現象相符。由于蜂螨的生命周期大部分是在蜂群巢房內的繁殖階段[3,11]，在越冬期無子脾的情況下進行治螨處理效果較好。經歷過漫長的冬季待到春繁期時，成年蜂體表已沒有蜂螨寄生(圖2)，進一步說明越冬期為治螨的關鍵時期，決定著來年春季蜂群的整體健康態勢。

兩次的測定結果說明不同種蜂場蜂群感染微孢子蟲程度存在顯著差異，而在多數蜂場蜂群微孢子蟲孢子數不多的情況下，蕭山蜂場和紹興蜂場分別在冬季和春季微孢子蟲孢子數明顯高于其它種蜂場的蜂群(圖3)，說明這兩個蜂場蜂群抗微孢子蟲能力可能較差。這兩家種蜂場在蜂王選種和育王時需更多考慮蜂群感染微孢子蟲的情況，逐步改善抗微孢子蟲的能力。

在越冬期，各個蜂場均有一定比例的蜂群感染BQCV、CBPV、DWV、IAPV和SBV等5種病毒，且其中較高感染比例的病毒為BQCV和DWV(圖4)，這與此前國內西方蜜蜂病毒流行性調查結果類似[9,12]。此外，蜂群被多種病毒同時感染是普遍的現象[13]，本研究的結果也是如此。除了江山蜂場蜜蜂體內IAPV感染率顯著高于千島湖蜂場，長興蜂場蜜蜂體內DWV感染率顯著高于紹興蜂場外，其它各組病毒感染率在越冬期和春繁期并沒有顯著變化(圖4)，這可能與各蜂群成年蜂體表蜂螨寄生率下降、蜂群抗病毒能力較強有關。整體而言，從越冬期到春繁期，除了BQCV以外，各個蜂場蜜蜂體內其它4種病毒的感染率呈現一定的下降趨勢。此前有報道顯示微孢子蟲與BQCV間具有一定的協同作用[14]，本研究中6家蜂場蜜蜂上微孢子蟲孢子數從越冬期到春繁期均有所增加，這可能是為什么BQCV感染率沒有隨著蜂群中蜂螨寄生率的下降而降低的原因。

從越冬期到春繁期，平均每群蜜蜂體內BQCV病毒感染滴度顯著上升；而相反地，DWV、IAPV和SBV病毒感染滴度從越冬期到春繁期則呈現顯著下降趨勢(圖5)。這種趨勢與前述病毒侵染率結果類似，也可能與各蜂群在春繁期蜂螨寄生率下降、蜂群抗病毒能力較強有關。由于蜜蜂病毒與蜂螨間聯系緊密[15]，DWV更是已經證明與狄斯瓦螨存在緊密的協同作用[16]，這也進一步解釋了為什么不同時期各蜂場間的蜜蜂病毒感染情況(除了BQCV)也基本差別不大，僅在較少的蜂場間存在病毒感染率和病毒感染滴度間的顯著差異。

本次測定僅選取了每家蜂場5群蜜蜂，而且在養殖過程中難免會有一些蜂群出現特殊情況(如盜蜂等)影響實驗結果。因此，在條件允許的情況下，今后應選取更多的蜂群開展測定。本研究發現各種蜂場蜂群均沒有表現出自然抗蜂螨能力，且抗螨能力沒有顯著差異，且不同種蜂場蜂群感染微孢子蟲程度存在顯著差異，部分蜂場蜂群感染微孢子蟲情況更為嚴重。此外，各種蜂場蜂群病毒感染情況都比較嚴重，且抗病毒能力沒有顯著差異，而這與蜂螨和微孢子蟲等寄生蟲的感染聯系較密切。在今后的蜜蜂飼養管理和蜜蜂育種工作中，有效防控蜂螨和微孢子蟲的侵染程度將有助于促進蜂群的抗病毒能力，增加蜂群的整體健康態勢。