溫針灸對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織ADAMTS-4及MMPs-3的影響

江 潤，張 濤，毛 珍，張紅星

（1.武漢協(xié)和江北醫(yī)院風(fēng)濕科，武漢 430100；2.武漢協(xié)和江北醫(yī)院康復(fù)疼痛科，武漢 430100；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢 430061）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis,KOA）是一種臨床常見的疾病，以關(guān)節(jié)軟骨、韌帶、包膜和肌腱等退化為病理表現(xiàn)[1-2]。本病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多與遺傳、代謝、年齡等因素密切相關(guān)[3-4]。研究表明，ADAMTS-4、MMPs-3 為關(guān)節(jié)軟骨外基質(zhì)的水解酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解，是關(guān)節(jié)退化的重要標(biāo)志[5]。故本次研究擬觀察溫針灸對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織ADAMTS-4、MMPs-3 的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取6～8 周齡雄性SPF 級SD 大鼠（180±20）g，40 只，均購于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號SCXK（鄂）2017-0012，喂養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心SYXK（鄂）2016-0057。飼養(yǎng)于SPF 級動物房，室溫20～25 ℃。本次實(shí)驗(yàn)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物福利委員會許可。所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組10 只（不做任何處理），模型組30 只。水合氯醛（國藥集團(tuán)公司，批號：32584210），單碘乙酸鹽（北京歐北生物科技有限公司，批號：408251756）；ADAMTS-4 抗體（美國ASPEN 公司，批號：HS-320145），MMPs-3 抗體（武漢三鷹，批號：125847-2-ap）；HRP 標(biāo)記羊抗兔二抗（上海生工生物有限公司，D110058 ）。華佗牌一次性無菌毫針，規(guī)格0.25×25 mm（江蘇醫(yī)療機(jī)械用品有限公司）；艾柱（南陽金堂艾制品有限公司）；自制鼠衣及固定裝置；電泳儀（北京市六一儀器廠，型號：DYY-6C）；酶標(biāo)儀（Diatek 公司，型號：DR-200Bs）；轉(zhuǎn)移電泳儀槽（北京市六一儀器廠，型號：DYCZ-400D）；X 線檢測設(shè)備（美國ASPEN 公司出廠）。

1.2 動物造模及分組 采用經(jīng)典KOA動物造模方法，膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶溶液制備KOA大鼠模型[6]。具體操作：所有大鼠，用10%水合氯醛，0.03 mL/g，腹腔注射麻醉，對大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)附近的鼠毛進(jìn)行清理，將膝關(guān)節(jié)處于屈曲45°；將4%木瓜蛋白酶溶液0.1 mL 注射到除正常組以外大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，隔日1 次，連續(xù)2 周。正常組，以同樣的方式，注射9%生理鹽水0.1 mL。造模2周后，采用X線進(jìn)行模型鑒定。

造模成功標(biāo)志。KOA 大鼠X 線示關(guān)節(jié)軟骨退化，脛骨平臺欠光滑，關(guān)節(jié)間隙變窄，或伴有唇樣骨贅。本次實(shí)驗(yàn)造模成功26 只，造模成功率86.67%。造模過程中，所有大鼠均正常飲食、自由攝水。將造模成功的大鼠分為模型組（8 只，僅造模），溫針灸組（9 只，造模后給予干預(yù)），針刺組（9 只，造模后，給予干預(yù)）。

1.3 方法 溫針灸組大鼠穿上自制鼠衣后，固定在裝置上，將雙側(cè)膝關(guān)節(jié)彎曲45°，充分暴露關(guān)節(jié)腔。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]取“后三里”和“膝前穴”。皮膚常規(guī)消毒，取0.25×25 mm 針具迅速刺入，刺入深度3～5 mm，停止進(jìn)針；將艾柱置于針柄，點(diǎn)燃艾柱，燃盡后，換另一壯，每次2 壯，連續(xù)治療10 d。針刺組僅給予針刺，不作艾灸處理，方法同溫針灸組。正常組與模型組不做任何處理。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 膝關(guān)節(jié)厚度及被動活動度 關(guān)節(jié)被動活動度=最大屈曲角度-最大伸展角度。

1.4.2 關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α含量 采用ELISA法檢測。最后一次治療后，大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，用注射器抽取2 mL 生理鹽水注射到大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，被動活動膝關(guān)節(jié)數(shù)次，抽取關(guān)節(jié)滑液，離心后取上層清液，于-80 ℃冰箱備用。按照ELISA 試劑盒操作說明，檢測關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α 含量。

1.4.3 軟骨組織中ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白含量 采用Western blot 檢測法。摘取大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，剝離軟骨組織，將軟骨組織粉碎；將少量軟骨組織加入0.5 mLRIPA 裂解液后，于2 ℃下15 000 r/min 離心10 min，取上清液；用DR-200Bs 酶標(biāo)儀測定蛋白濃度，對待測蛋白進(jìn)行上樣，依次完成電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及免疫印跡顯色等步驟。采用Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.4.4 滑膜組織中ADAMTS-4、MMPs-3 的mRNA 表達(dá) 取少量滑膜組織于液氮中研磨成粉末，用Trizol試劑提取組織RNA，并測定RNA 濃度；將提取的RNA 樣品進(jìn)行cDNA 合成；將cDNA 樣品置于RTPCR 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；以GAPDH 作為內(nèi)參，選用待測mRNA 相對含量。PCR 引物列表見表1。

表1 引物序列情況

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，先采用ShaPiro-Wilk 檢驗(yàn)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較，采用單因素方差分析，若組間有差異，采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較；若不符合正態(tài)分布，選擇Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料，采用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 正常組與模型組膝關(guān)節(jié)X 線檢查結(jié)果 正常組關(guān)節(jié)間隙正常，關(guān)節(jié)軟骨厚度適中；模型組關(guān)節(jié)間隙變窄，伴輕度骨贅，軟骨變薄。表明膝骨關(guān)節(jié)炎模型造模成功。

2.2 各組膝關(guān)節(jié)厚度及被動活動度 見表2。

表2 各組膝關(guān)節(jié)厚度及被動活動度比較

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α 含量 見表3。

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α 含量（）μg/L

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-6、TNF-α 含量（）μg/L

注：與正常組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.4 各組大鼠軟骨組織中ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白表達(dá) 見表4、圖1。

表4 各組大鼠滑膜組織ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白相對含量（）

表4 各組大鼠滑膜組織ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白相對含量（）

注：與正常組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

圖1 各組大鼠滑膜組織ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白表達(dá)情況

由表4、圖1 可知，與正常組比較，造模組ADAMTS-4、MMPs-3 含量升高，P＜0.05；與針刺組比較，溫針灸組ADAMTS-4、MMPs-3 含量更低，P＜0.05。

2.5 各組大鼠滑膜組織中ADAMTS-4、MMPs-3 的mRNA 相對表達(dá) 見表5。

表5 各組大鼠滑膜組織ADAMTS-4、MMPs-3 的mRNA 相對含量（）

表5 各組大鼠滑膜組織ADAMTS-4、MMPs-3 的mRNA 相對含量（）

注：與正常組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

3 討論

隨著人口老年化趨勢，膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率日益增加[8-9]。當(dāng)前西醫(yī)對本病多采用藥物（非甾體抗炎藥）治療、手術(shù)治療等，但手術(shù)療法容易造成二次損傷，藥物服用容易產(chǎn)生依賴性，這些療法只能暫時(shí)緩解患者的癥狀[10]。溫針灸作為祖國醫(yī)學(xué)的特色療法，將針刺效應(yīng)與艾灸的溫?zé)岽碳そY(jié)合，發(fā)揮溫通經(jīng)絡(luò)，疏通氣血之效[11]。大量研究證明，溫針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎的有效性，但其作用機(jī)制尚未完全明確[12-13]。

ADAMTS-4 是一類參與膝關(guān)節(jié)軟骨退化的酶類[14]。研究[15]表明，如果對小鼠ADAMTS-4 基因進(jìn)行敲除，小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率明顯降低。關(guān)節(jié)軟骨受機(jī)械摩擦長期刺激，會激活A(yù)DAMTS 系統(tǒng)，導(dǎo)致ADAMTS-4 含量增加，從而加速軟骨破壞，使軟骨變硬變薄。體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)表明，膝骨關(guān)節(jié)炎早期ADAMTS-4 是參與聚蛋白多糖酶裂解的主要酶類，給予ADAMTS 抑制劑，聚蛋白多糖降解受到抑制[16]。因此調(diào)節(jié)ADAMT 活性可以作為防治KOA 的新靶點(diǎn)。MMPs-3 作為MMPS 家族成員，由軟骨細(xì)胞分泌，存在于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，降解蛋白、多糖等物質(zhì)，參與關(guān)節(jié)軟骨的破壞[17]。研究[18]表明，MMPs-3 并非單一作用，若MMPs-3 含量增多，能激活其他MMPs 成員，產(chǎn)生聯(lián)合反應(yīng)，加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞，MMPs-3 代謝產(chǎn)物能誘導(dǎo)T 細(xì)胞活化，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)。研究[19]表明，在膝骨關(guān)節(jié)炎不同階段，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞存在大量的MMPs，關(guān)節(jié)軟骨的抗應(yīng)力因此下降，骨代謝異常，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞基質(zhì)加速降解，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)退變。史廣強(qiáng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)，膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清MMP-3水平均明顯高于健康人群，MMPs-3 分泌失衡是引起關(guān)節(jié)軟骨退行性變的主要原因。因此，在KOA 的發(fā)病過程中，MMPs-3 是促進(jìn)關(guān)節(jié)滑膜炎癥、關(guān)節(jié)軟骨降解最重要的酶，也是反映關(guān)節(jié)軟骨退變程度的重要標(biāo)志物。IL-6、TNF-α 為一類促炎性細(xì)胞因子，能介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)，能誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分泌ADAMTS-4、MMPs-3，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，加速軟骨退化[21]。本次研究中，溫針灸組KOA 大鼠關(guān)節(jié)炎中IL-6、TNF-α 含量均低于造模組，表明溫針灸能減輕KOA 大鼠關(guān)節(jié)液中的炎性反應(yīng)。在滑膜組織中，溫針灸組大鼠ADAMTS-4、MMPs-3 蛋白表達(dá)及mRNA 相對含量均低于造模組、針刺組。由此可知，溫針灸對KOA 大鼠的作用機(jī)制可能是通過抑制ADAMTS-4、MMPs-3 表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)，從而減少膝關(guān)節(jié)厚度，增大膝關(guān)節(jié)被動活動度。