CXCL12/CXCR4與子癇前期及其肝功能異常的相關性研究*

蔣曉敏 周小娟 李意

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期一種特有的高血壓疾病，有調查表明其影響全球0.2%～9.2%的孕婦，是導致母嬰發病及死亡的主要原因之一[1]，其早期被定義為在妊娠20周后出現的妊娠特異性綜合征，除高血壓外，其他臨床表現如蛋白尿、全身性水腫也是子癇前期患者最常見的癥狀和體征[2，3]。子癇前期的發病機制尚未完全明確，目前被大眾認可的學說是滋養細胞侵襲不足，釋放免疫-炎癥細胞因子，導致血管內皮損傷及全身炎癥反應[4]。目前已有大量研究[5-8]表明趨化因子與其受體結合在胚胎發育、血管生成及母體免疫-炎癥反應等多種生理或病理過程中發揮重要作用。其中趨化因子12（CXC chemokine ligand，CXCL12）又稱為基質細胞衍生因子-1（stromal cell-derived facror-1），與趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）結合可以通過調控下游信號分子通路，促進Th1類細胞分泌抗炎細胞因子，使母胎界面保持免疫耐受狀態[9]，且CXCL12/CXCR4已被證實廣泛表達于腦、心臟、肝、腎、脊髓等部位，參與細胞免疫調控的過程[10]。國內有報道[11]顯示CXCL12/CXCR4表達下調造成母體免疫-炎癥失衡、滋養細胞侵襲不足及子宮螺旋動脈重塑不全，從而導致子癇前期的發生。同時相關研究發現CXCL12/CXCR4水平的變化與肝功能異常也有一定相關性[12-13]，并且CXCL12/CXCR4信號通路在慢性肝病中發揮重要的保護作用[14]。本研究通過檢測血清中CXCL12/CXCR4、ALT及AST水平，探討CXCL12/CXCR4在子癇前期中的作用及參與子癇前期患者肝功能異常的發病機制。

資料與方法

1 一般資料 選擇2018年5月～2019年5月在安徽醫科大學附屬婦幼保健院住院分娩的子癇前期患者65例為PE組，將PE患者進一步分為輕度PE患者23例（輕度PE組）和重度PE患者42例（重度PE組），選擇同時期正常晚期妊娠孕婦51例為對照組。入組標準：（1）符合子癇前期、輕度子癇前期及重度子癇前期的診斷標準，參照全國統編教材第9版《婦產科學》[15]；（2）單胎，孕＞20周；（3）年齡18～45歲（4）無其他產科合并癥及并發癥；（5）既往無炎癥性疾病及內分泌系統、自身免疫系統疾??；（6）所有孕婦均以剖宮產終止妊娠；（7）以上病例均未經特殊藥物治療，并經副主任醫師及以上人員診斷后納入研究對象。參與研究對象均知情同意，已獲得醫院倫理委員會批準，倫審批件號為Fyllhwk2018zd013。

2 研究方法

2.1 標本采集：隨訪兩組研究對象至分娩，收集相關臨床資料。符合條件的研究對象在入院后完善相關檢查，在未使用特殊藥物治療前空腹抽取靜脈血4～5 mL，3 500 r/min離心5 min，取上清于EP管中，置于–80℃冰箱保存待測。采用ELISA法檢測各組血清中CXCL12、CXCR4水平，檢測時嚴格按照相關ELISA試劑盒的操作步驟，同時記錄研究對象入院后空腹血ALT及AST的結果。

2.2 標本檢測：采用武漢基因美科技公司CXCL12/CXCR4因子ELISA試劑檢測盒（JYM1707Hu＆GR2019-12/JYM0103Hu＆GR2019-12）進行檢測。操作步驟：①標準品的稀釋；②加樣：分別設置空白孔及待測樣品孔，其中空白對照孔內不加樣品和酶標試劑，其余各操作步驟均相同。先將樣品稀釋液40 μL加入酶標包被板上的待測樣品孔當中，之后再將待測樣品10 μL加入其中，樣品的最終稀釋度為5倍。之后取樣品加于酶標板孔的底部，加樣的操作過程中不要觸及孔壁，之后輕輕晃動混合均勻；③加酶：除空白孔外將酶標試劑50 μL分別加入每個孔當中；④溫育：使用封板膜封板，并置于37℃的條件下溫育，時間為30 min；⑤配液：使用蒸餾水將濃縮洗滌液稀釋30倍（48T的20倍）備用；⑥洗滌：揭掉封板膜，在棄去液體之后甩干，然后在每孔加滿洗滌液靜置，時間約為30 s，之后再棄掉，反復操作5次，拍干；⑦顯色：先將顯色劑 A（ZLI-9018＆108038A08）50ul加入每孔當中，之后再將顯色劑 B（ZLI-9018＆108038A08）50 μL加入到每孔中，輕輕晃動混合均勻，置于37℃進行避光顯色，時間約10 min；⑧終止：將終止液50 μL分別加入到每個孔當中，終止反應，藍色立即轉為黃色；⑨測定：采用空白孔調零，450 nm 波長按序測每個孔的吸光度，即OD值，此操作在加入終止液后的15 min內進行。

3 統計學處理 利用統計軟件SPSS23.0進行統計學分析，數值變量資料采用Shapiro-Wilk（S-W）方法進行正態分布檢驗，符合正態分布的計量資料以均值±標準差（）表示，多組組間比較采取方差分析，非正態分布資料采用Kruskal-wallis秩和檢驗；變量間的相關性用Spearman相關分析，采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）分析CXCL12/CXCR4對子癇前期的診斷價值，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 三組間一般臨床資料、血清CXCL12/CXCR4表達水平比較 三組間孕婦年齡無明顯差異，但分娩孕周及新生兒體重差異有統計學意義（F=99.4、134.2，P＜0.001），進一步兩兩比較，重度PE組分娩孕周及新生兒出生體重明顯低于對照組及輕度PE組；比較輕、重度PE組與對照組間母體血清CXCL12/CXCR4水平，差異有統計學意義（F=198.1、572.9，P＜0.001），兩兩比較，對照組、輕度PE組及重度PE組母體血清CXCL12/CXCR4水平均依次下降（P＜0.017），見表1。

表1 三組間孕婦一般臨床資料及血清CXCL12/CXCR4水平的比較（）

表1 三組間孕婦一般臨床資料及血清CXCL12/CXCR4水平的比較（）

2 正常對照組與輕、重度PE組間母體血清ALT、AST水平的比較 采用秩和檢驗對對照組與輕、重度PE組間母體血清ALT、AST水平進行比較，三組間母體血清ALT及AST水平不全相同（H=32.7、23.7，P＜0.001），三組間兩兩比較，重度PE組母體血清ALT水平高于輕度PE組及對照組，且重度PE組及輕度PE組母體血清AST水平明顯高于對照組（P均＜0.017），輕度PE組與對照組ALT水平無統計學差異，重度PE組與輕度PE組AST水平無統計學差異（P均＞0.017），見圖1。

圖1 正常對照組與輕、重度PE組間母體血清ALT、AST水平的比較

3 血清CXCL12/CXCR4診斷子癇前期的ROC曲線分析 ROC曲線分析結果顯示，血清中CXCL12濃度以2477.68 pg/mL作為最佳截斷值，診斷子癇前期的ROC曲線下面積為0.981，靈敏度為92%，特異度為94%，（95%CI：0.963-0.999），血清中CXCR4以2125.97 pg/mL作為最佳截斷值，診斷子癇前期的ROC曲線下面積為0.996，靈敏度為95.4%，特異度為100%，（95%CI：0.960-1.000），見圖2。

圖2 CXCL12/CXCR4診斷子癇前期的ROC曲線圖

4 母體血清CXCL12/CXCR4與ALT、AST的相關性 經Spearman相關分析顯示，母體血清CXCL12與ALT（r=–0.486）、AST（r=–0.386）呈顯著負相關，母體血清CXCR4也與ALT（r=–0.474）、AST（r=–0.403）呈負相關，差異有統計學意義（P均＜0.001），見圖3。

圖3 母體血清CXCL12/CXCR4與ALT、AST的散點圖

討 論

目前，國內外較為公認與子癇前期患者胎盤功能異常相關的幾種病因學說包括：氧化應激學說、胎盤缺血和缺氧學說及免疫-炎癥學說。學者們普遍認為是由于滋養層細胞侵襲不足及子宮螺旋動脈重鑄不足，導致胎盤持續性缺氧，從而釋放各種炎癥因子進入母體循環。其進展可分成兩個階段，第一個階段為妊娠早期胎盤血流灌注減少，造成氧化應激，第二個階段為妊娠中晚期母體全身血管內皮細胞廣泛損傷、血管痙攣，同時全身系統性的炎癥反應又進一步加重胎盤的氧化應激，其中CXCL12/CXCR4信號通路通過趨化多種細胞因子在調節免疫-炎癥反應中的作用成為人們日益關注的焦點[16]。

1 血清CXCL12/CXCR4與子癇前期的相關性 有研究[17]發現與正常孕婦比較，子癇前期患者母體血清中CXCL12的表達顯著降低，表明母體血清CXCL12水平異?？赡軈⑴c子癇前期的發病。LU等[18]學者的研究結果也證實子癇前期患者胎盤組織中滋養層細胞凋亡趨勢較正常胎盤組織更加明顯，且通過免疫組化法檢測到子癇前期患者胎盤組織中CXCL12/CXCR4水平與正常對照組的顯著差異，表明CXCL12/CXCR4異常表達可能是子癇前期發病的重要機制。此外，ZHAO等[19]證實CXCL12/CXCR4/CXCR7軸可以活化表皮生長因子受體進一步激活ERK信號通路，促進滋養細胞的存活，抑制滋養細胞的凋亡，提示CXCL12/CXCR4及CXCR7的水平降低與子癇前期滋養細胞凋亡有一定的相關性。在本研究中，輕、重度PE組母體血清CXCL12/CXCR4水平較正常對照組明顯降低，且重度PE組母體血清CXCL12/CXCR4水平明顯低于輕度PE組。血清CXCL12以2477.68 pg/mL作為最佳截斷值，診斷子癇前期的ROC曲線下面積為0.981，靈敏度為92%，特異度為94%，（95%CI：0.963-0.999），血清CXCR4以2125.97 pg/mL作為最佳截斷值，診斷子癇前期的ROC曲線下面積為0.996，靈敏度為95.4%，特異度為100%，（95%CI：0.960-1.000），顯示出較高的診斷效能。因此，在高血壓及蛋白尿等臨床表現并不明顯的子癇前期患者或者HELLP綜合征者中，檢測母體血清CXCL12/CXCR4水平有助于更加準確地診斷出子癇前期。

2 血清CXCL12/CXCR4與子癇前期患者肝功能異常的相關性 近年來有報道表明機體全身炎癥反應引起的周圍血管收縮和內皮細胞損傷不僅可導致子癇前期的發生，也是造成大多數急性肝臟損傷的發病機制，其中趨化因子通過吸引和激活免疫炎癥細胞，并協調細胞之間的相互作用而在疾病的發生、發展中起重要作用。有研究報道[20]趨化因子CXCL12在與受體CXCR4結合后，誘導分子構象發生改變，通過激活下游ERK1/2，MAPK，JNK 及AKT等信號通路，招募間充質干細胞至肝損傷部位進行修復。也有研究[13]證實CXCL12/CXCR4信號通路通過誘導肝前體細胞及卵圓細胞的擴增，從而實現了CXCL12在肝臟損傷過程中的保護作用，另一方面SAIMAN等[21]人通過小鼠模型發現特異性抑制CXCL12/CXCR4信號通路后可使小鼠肝臟內中性粒細胞含量明顯增加，引起肝臟炎癥反應的加重，導致肝臟的進一步損傷。此外，CHALIN等[12]學者通過研究急性肝損傷的炎癥生物標志物，意外發現循環血清中CXCL12異常表達的產科組病人，其血清ALT及AST水平均有不同程度的升高，同時病人多合并有子癇前期，這一研究結果更加證實血清CXCL12水平與子癇前期患者肝功能異常的發生存在一定的相關性。本研究結果與上述報道相符，輕、重度子癇前期組血清中CXCL12/CXCR4水平顯著低于對照組，且子癇前期患者血清中ALT、AST水平明顯增高，同時相關分析顯示母體血清CXCL12及CXCR4水平與肝功能之間呈負相關，提示子癇前期患者血清中CXCL12/CXCR4水平的降低可能參與其肝功能異常的發病機制，這一變化也可同時反映出患者的病情呈加重的趨勢。

綜上所述，本研究結果顯示母體血清CXCL12/CXCR4水平的降低可能與子癇前期的發病有著重要聯系，其表達量的異常也可能是導致子癇前期患者肝功能異常的發病機制。本研究為進一步探討子癇前期發病機制及診治子癇前期患者肝功能異常提供了新的思路。但本研究尚有局限性，一是樣本量小，尚需多中心、前瞻性、大樣本的研究證實CXCL12/CXCR4在診斷子癇前期中的應用價值，二是本研究未檢測趨化因子受體CXCR7的水平，后續研究可聯合血清CXCR7的檢測以提高CXCL12/CXCR4/CXCR7在子癇前期診斷中的準確性，為治療子癇前期肝功能異常提供一定的理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突