儲存血細胞中非編碼RNA研究進展*

苑召虎 魏亞明

輸血醫學已經成為臨床醫學中不可或缺的重要組成部分，保障患者安全、有效、合理和經濟的用血是臨床醫療機構輸血治療技術水平的重要體現。成分輸血是臨床輸血治療主要標志[1]。臨床上，紅細胞輸注的主要目的是為了提高血液中的氧合血紅蛋白含量，血紅蛋白與從肺部吸入的氧氣結合，運送到身體各個器官組織，從而改善機體缺氧狀態。血小板成分輸注在臨床治療上被廣泛應用于治療血小板減少或血小板功能障礙相關疾病，血小板通過內皮下組織的膠原纖維結合蛋白以及凝血酶等激活后，發生變形、釋放和聚集等一系列反應，起到初期止血的作用。

血液離開機體在體外儲存過程中會發生一系列生理生化、形態結構和功能變化，稱為“儲存損傷”。研究顯示，儲存紅細胞的生化、形態學和組學特征在大約14天后發生了明顯的變化，血液流變學指標發生明顯改變，血液粘度和聚集性增高，紅細胞變形能力下降，通過毛細血管時容易遭到破壞從而加重局部缺血。紅細胞的體外儲存損傷除引起紅細胞直接破壞外，還可促進紅細胞自殺性程序性死亡，即衰亡（eryptosis）[2]。研究顯示儲存損傷可促進受者血液中1/4以上儲存紅細胞在輸注24 h后迅速清除[3]。我們及他人的研究顯示，一氧化氮（NO）可有效改善紅細胞變形能力，血液粘度下降，使血流阻力減少，血流流速增加，改善了血液流變特性，增加了血液攜氧和運輸營養物質的能力[4，5]。與紅細胞相似，血小板在保存期間也會發生形狀和生物化學變化，這些變化包括血小板圓盤狀消失，形態由雙面凸形向球形轉變、樹枝突起及偽足生成，導致血小板膜糖蛋白的改變。血小板保存過程中的代謝導致耗氧增加，使乳酸大量堆積、酸度升高、pH下降，進而導致血小板活化、血小板顆粒分泌并釋放出內容物，其“活化”的形態學變化還常伴有凋亡，進而導致其體外功能的變化，如粘附和聚集等，反映了血小板在儲存期間完整性和功能的喪失[6]。

紅細胞和血小板都屬于無核細胞，但研究顯示在紅細胞及血小板胞漿中仍存有大量的非編碼RNA（Non-coding RNA，ncRNA），而且這些非編碼RNA對紅細胞和血小板的發育至關重要，這些非編碼RNA根據堿基長度可以分為短鏈RNA［如微小RNA（MicroRNA，miRNA）、內源性小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）、與Pi蛋白相互作用 RNA（Piwi-interactiing RNA，Pi RNA）］、長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNAs，lncRNA）以及與以上線性結構不同的環狀RNA（circular RNA，circRNA）等[7-10]。非編碼RNA是參與基因轉錄后調控的小分子RNA，其本身并不編碼任何蛋白質，只能通過逆向調節靶基因（mRNA）來調節蛋白質的合成與分解[11]。不同造血細胞中ncRNA存在不同的表達類型，以此可以區分不同的造血細胞系，且不同的ncRNA在造血細胞系的不同階段發揮的作用不同[12]。近年來，研究顯示在紅細胞或血小板在體外儲存過程中，ncRNA呈現不同表達狀態，有可能成為“儲存損傷”的標志物[8-10]。雖然紅細胞、血小板仍存在體外低溫存儲的情況，如-80℃保存的冰凍血小板及冰凍甘油紅細胞等，但目前關于儲存血細胞中非編碼RNA的研究都集中在常規保存條件下（紅細胞在4±2℃保存，血小板在22±2℃保存）。

1 miRNA miRNA是一種內源性、廣泛存在于真核生物中的單鏈小RNA。miRNA基因以單拷貝、多拷貝及基因簇的形式離散地分布在基因組中，其中70%～90%位于間隔區，其余位于內含子或外顯子上。大多數miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ作用下轉錄產生幾百至幾千個核苷酸的初級miRNA產物（pri-miRNA），在細胞核內被RNaseⅢ內切酶家族的Drosha酶切割成70個核糖核苷酸左右的發夾狀前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA在轉運蛋白的作用下轉運出核，然后經Dicer酶切割成長度約19～25個核苷酸的成熟miRNA[13,14]。miRNA在多種生命過程中發揮著重要作用，其在特定的細胞或組織、時間、發育階段才會表達，提示它對組織的發育有著潛在的重要作用[7-9]。

1.1 miRNA在體外儲存紅細胞中的表達及其在儲存損傷的作用：miRNA在造血過程中的重要作用早期已有報道，近期人們發現成熟紅細胞內含有大量miRNA。2010年，MEGANATHAN KANNAN等首次提供了存儲紅細胞的miRNA差異圖譜，為識別新的儲存損傷的RBC生物標志物開辟了新的途徑，提出了儲存紅細胞可能存在靶基因-miRNA調控途徑[1]。2015年，CHINTAMANI ATREYA通過在人有核紅細胞系過表達hsa-miR-196a，證實了hsamiR-196a對紅細胞衰亡和ATP消耗的保護作用[2]。隨后探索了AGO2-miRNA復合體在成熟紅細胞中的作用。我們通過基因芯片研究顯示，當儲存20天紅細胞與新鮮組比較時，有109個miRNA在儲存過程中表達上調和102個基因表達下調。經RT-PCR驗證的13個miRNAs中，miR-31-5p、miR-196a-5p、miR-203a、miR-654-3p，miR-3591-5p和miR-769-3p表達上升，let-7a-3p、miR-96-5p、miR-150-5p和miR-197-3p表達下降，具有明顯變化趨勢的miRNAs可以作為“儲存損傷”的生物學標志物[15]。其中，miR-196a-5p、let-7a-3p、miR-96-5p、miR-150-5p、miR-145-3p和miR-197-3p被證實與RBC和血小板儲存過程中的凋亡信號通路有關，其中miR-196a-5p、miR-96-5p、miR-150-5p和miR-197-3p在紅細胞儲存0～20天時表現為上升趨勢，let-7a-3p和miR-145-3p在紅細胞整個儲存過程中均保持較低水平，let-7b可作為分期特異性紅細胞轉錄程序的關鍵調控因子，而miR-150-5p的下調是紅細胞生成所必需的；miR-96-5p在網織紅細胞中亦高表達，與Hb形成有關[16，17]。通過KEGG預測分析顯示，miR-203a、miR-654-3p和miR-31-5p表達上調調節CASP10表達下調；miR-203a和miR-196a-5p表達上調調節CASP8表達下調；miR-31-5p表達上調調節MAP3K14表達下調；miR-203a表達上調調節IL3表達下調；miR-203a、miR-654-3p、miR-3591-5p和miR-31-5p表達上調調節PPP3CA表達下調；miR-203a、miR-654-3p和miR-3591-5p表達上調調節ATM表達下調，從而抑制凋亡，延長紅細胞儲存時間[5，17]。SARACHANA等學者分析發現了四種與紅細胞儲存損傷相關的mricoRNA，通過RT-PCR分析發現這4個miRNA在第14天和第28天存在差異表達。生物信息學分析確定了這些miRNA的潛在靶點和生物學功能。在人紅細胞細胞系中過表達hsa-miR-196a證實了它對細胞死亡和ATP丟失的保護作用[8]。

1.2 miRNA在體外儲存血小板中的表達及其在儲存損傷的作用：與紅細胞相似，血小板中亦含有大量的miRNA，這些miRNA表達量隨著血小板在體外保存時間的延長，呈現不同變化趨勢。在體外儲存血小板中miRNA表達量降低為主要趨勢，升高的miRNA數量遠少于降低的miRNA，這些變化的miRNA可通過調控相應的蛋白表達來影響血小板的聚集功能。如在血小板活化聚集通路中miR-223、miR-21、let-7b可通過相關的mRNA來調節血小板中蛋白表達，進而影響血小板的聚集功能。血小板miRNA的靶基因還與血小板活化、脫粒、血小板源生長因子受體信號通路及干細胞分化等相關。其中miR-223顯示了對P2Y12的調控、對血小板活化通路的影響，且具有易檢測的特征，具備成為首個血小板儲存損傷的生物學標記的潛質[18]。在人類中，估計約60%的蛋白編碼基因受miRNAs的調控，并被認為參與了大部分的生理和病理過程。在血小板儲存條件下，miRNAs繼續發揮活性，血小板貯藏過程中與血小板表型相關的miRNA-mRNA表達可能發生改變。多種靶向預測顯示一個miRNAs可以靶向多個mRNA，大多數mRNA被多個miRNAs靶向，揭示了miRNA譜和血小板反應性之間的聯系[19]。

KANNAN等學者通過膜陣列miRNA分析明確了血小板儲存凋亡相關的52個miRNA，研究顯示miR-150、miR-151、miR-152、miR-184、miR-188、miR-196a、miR-197和miR-202在血小板的體外儲存期間始終保持較高水平；Let-7b和miR-16在PLT存儲過程中表現出顯著增加的趨勢，而miR-7和miR-145表現出顯著下降的趨勢，并進一步通過生物學信息預測出這四個miRNA潛在的靶mRNA，為血小板存儲相關病變的分子機制提供新的見解[7]。通過KEGG數據庫及相關文獻推測miRNA與血小板活化聚集過程存在有調控關系，如let-7b影響GPⅢa從而影響血小板聚集過程，miR-223參與對P2Y12 mRNA表達的調控，從而影響P2Y12蛋白的合成，miR-21也可能作用于P2Y12[18]。此外，miR-326可下調抗凋亡基因Bcl-xL的表達外，進而引起血小板凋亡[20]。與上述結果一致的是，在血小板儲存過程中miR-16靶基因的增加參與了凋亡。DAHIYA等還發現在儲存的血小板中，miR-570可與編碼mRNA的線粒體ATP酶亞基g（ATP5L）相互作用，因此，miR-570也可以作為存儲血小板質量和活性的生物標志物之一[21]。通過ApoE-/-小鼠模型研究顯示來源于小鼠血小板的miR-25-3p可通過NF-κB以減輕脂質氧化[22]。miR-96可以作用于VAMP8相關的mRNA，VAMP8可通過影響ADP在血小板活化聚集通路中起作用，miRNA-96含量與VAMP8蛋白及其mRNA的含量呈反比，并且miRNA-96具有抑制VAMP8蛋白表達的作用，從而可降低血小板的活化能力[23]

2 長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）lncRNA是一種長度大于200bp，不能編碼蛋白質，具有重要調控功能的轉錄本。大量研究證實lncRNA可在表觀遺傳、轉錄、翻譯和蛋白修飾等四個水平調控基因的表達，在細胞分化、增殖、凋亡等過程中發揮重要作用。lncRNAs在不同的組織，發育階段和生理情況下的表達也不同；有些是生命所必需的，有些只是特定的發育階段或生理功能所必需的。lncRNA與DNA、RNA及蛋白質通過多種方式相互作用，通過堿基互補配對或者是形成結構域來發揮調節作用。

2.1 lncRNA在體外儲存紅細胞中的表達及其在儲存損傷的作用：截至投稿，關于lncRNA在RBC中功能的研究，更多的集中在紅系祖細胞的分化、白細胞激活和DNA修復上，與紅細胞儲存損傷相關研究尚處于早期階段；早期丁楠等學者通過高通量測序技術獲得轉錄組數據，從臍帶血造血干細胞到無核成熟的紅細胞共六個階段（即HSC、P2、P3、P4、P5和無核RBC六個階段）中研究發現了1 034個已知lncRNAs，明確了35 090對lncRNAs-基因潛在的互作關系，綜合分析表明lncRNA可參與調控紅細胞的成熟，特別是與血紅蛋白代謝、對氧反應性和DNA損傷的有關[24]。JUAN等學者通過全基因組分析發現了多種在紅細胞生成過程中動態表達及顯示表觀遺傳調控的lncRNAs，這些lncRNAs可被關鍵的紅細胞轉錄因子GATA1、TAL1或KLF1靶向控制，這些lncRNA的耗盡可嚴重損害紅細胞的成熟，抑制紅細胞體積的減小及去核過程[25]，如lncRNA shlnc-EC6可通過Rac1/PIP5K信號通路調節小鼠胚胎成熟紅細胞的去核[24]。

2.2 lncRNA在體外儲存血小板中的表達及其在儲存損傷的作用：早期我們通過芯片研究顯示在人血小板儲存過程中有大量的lncRNA表達發生改變，第5天與第2天相比，有162種lncRNA表達發生了變化，升高的有4種，降低的有158種；第8天與第2天相比，有691種lncRNA發生變化，表達升高的有20種，降低的有671種；第8天與第5天相比，有246種lncRNA發生變化，有2種表達升高，244種表達降低，分析表明部分變化的lncRNA與血小板聚集、血小板激活、內吞等生理過程相關。KEGG功能分析顯示lnc-WBSCR16-3∶6、lnc-CHD1L-1∶10、lnc-EWSR1-2∶1及lnc-PIM2-1∶1與內吞途徑高度相關。血小板激活也在KEGG分析統計中被高度富集，血小板儲存損傷發生時，血小板首先發生激活，釋放出一系列炎癥因子，同時伴隨著血小板凋亡的發生，其生理功能和存活率顯著下降。KEGG分析表明lnc-FAM75A7-2∶5、lnc-MARCH6-2∶1、lnc-TMEM86B-2和lnc-TOMM22-1∶1在血小板激活中具有重要的意義，為進一步探究血小板儲存損傷機制提供了新的靶點[26]。cis調控分析得出lncRNA-mRNA可能的相互調節關系如下：lnc-USP39-1調控VAMP8的表達；lnc-TMEM86B-2調控GP6的表達；lnc-MAPK13-3調控MAPK14的表達；lnc-FOXS1-2調控BCL2L1的表達；lnc-CAPN2-1調控CAPN2的表達等等，這些調控關系與血小板的激活或凋亡有著密不可分的聯系[27-29]。研究顯示血小板lncRNA表達量隨著血小板儲存時間的延長而呈不同的變化趨勢，下調的lncRNA數量較多，且下調幅度更明顯，lncRNA的表達隨著血小板生理狀態的變化而改變，部分變化的lncRNA與血小板生理功能相關，并且在血小板儲存損傷中發揮作用[26]。

3 環狀RNA（circular RNA，circRNA）circRNA是一類新的共價閉合單鏈RNA，通過特殊的選擇性剪切，由外顯子或內含子衍生而來。circRNA的主要生物學功能有miRNA sponge、調控蛋白結合、調控基因轉錄、編碼功能。由于沒有游離的ploy(A)末端，環狀RNA對RNA核酸外切酶和脫支酶存在一定的抗性，無論在細胞核中還是在細胞質中都可穩定存在[3]。

3.1 circRNA在體外儲存紅細胞中的表達及其在儲存損傷的作用：研究顯示有核細胞的circRNA豐度約占細胞總mRNA的2%～4%，在無核的血小板和紅細胞這一比例更高，已經證實多個circRNA比人類紅細胞中的相對應線性mRNA高出50到1 000倍。在造血系統中，通過RNA-seq分析鑒定出造血細胞表達的55 187個環狀RNA，數據顯示顯著的細胞類型特異性和非編碼轉錄本在造血過程中的潛在調控作用。在所有造血細胞中，血小板和紅細胞含有的circRNA數量最多，并且circRNA的類型和數量在成熟過程中發生變化[4，5]。紅細胞及血小板沒有細胞核，它們需要使用RNA來維持其功能，對環境因素作出反應，或通過微囊泡向其他細胞傳遞信號[6，7]。紅細胞中circRNA豐度高，穩定性好，可作為紅細胞儲存損傷的標志物，此外，circRNA在紅細胞代謝和儲存病變中也起著重要調控作用。

早期我們通過高通量測序分析在儲存紅細胞中發現了2 586個已知的和6 216個新發現的circRNA，儲存紅細胞中存在100多種表達差異的circRNA，其中下調的circRNA數量較多，且下調幅度比升高幅度更大。mireap、miranda、targetscan和mirTarBase預測顯示有多個circRNA可靶向作用于miRNA和mRNA，如通過CirRNA-miRNA-mRNA分析得出：hsa_circ_00007470的兩個靶miRNA，即hsamiR-155-5p與hsa-miR-6827-5p的靶蛋白是MRP4。hsa_circ_00007470和其靶miRNA都起著調控MRP4的作用。hsa_circ_00007470或許能通過解除miRNA對MRP4的抑制作用通過ATP代謝改善紅細胞變形能力。生物信息學分析顯示這些變化的circRNA主要與泛素介導的蛋白水解、RNA降解、RNA轉運、cAMP信號通路、紅細胞粘著連接、TGF-β信號轉導、AMPK信號通路及細胞周期中凋亡通路等生理過程相關。我們研究顯示circRNA.0007127可能通過吸附miR-513a-5p，促進下游靶基因CASP8表達，進而調控紅細胞的細胞凋亡，這一過程類似于K-562氧化應激反應中的調控過程。在整個紅細胞儲存期，泛素介導的蛋白水解通路一直為變化最為顯著，其余通路的名稱及排名隨儲存時間發生變化，說明circRNA的差異表達與紅細胞生理狀態改變有一定敏感性與相關性[30]。此外，JENNIFER F.DOSS等人分析發現miR-4732-3p可靶向作用于SMAD2和SMAD4，這兩種關鍵成分涉及TGF-β途徑與紅細胞生成有關[31]。

3.2 circRNA在體外儲存血小板中的表達及其在儲存損傷的作用：目前，關于circRNA在紅細胞儲存損傷中的研究尚處于早期階段。MASS等人研究顯示在儲存血小板中有3 324個circRNA表達。血小板雖然缺乏細胞核，但與其他組織相比，血小板中含有更多circRNA的表達。如在ACVR2A和SMARCA5中circRNA的表達顯著高于mRNA。circRNA在磷酸二酯酶PDE3A、PDE4D和PDE5A中表達也得到了驗證，PDEs可水解cAMP和cGMP，控制血管舒張、心臟收縮和抑制血小板聚集[32]。此外，血小板還可將胞漿中circRNA血小板囊泡（微囊泡和外泌體）釋放到體外發揮作用[33]。

4 其他非編碼RNA 紅細胞和血小板中除含有大量的miRNA、lncRNA及circRNA外，亦含有部分siRNA及PiRNA。SiRNA是一類雙鏈RNA分子，長度為20～5個堿基對，它可干擾表達與其互補的核苷酸序列的mRNA，從而防止翻譯，目前體外過表達的siRNA常用于各種分子生物學實驗，但是目前仍未見有內源性siRNA在體外儲存紅細胞及血小板中相關作用的報道[7-10]。PiRNA是一類含有24～31個核苷酸殘基的非編碼RNA，可通過結合argonaute蛋白的PIWI亞家族發揮作用，具有維持基因組穩定以及調節表觀遺傳學、生殖干細胞分化、胚胎發育等功能，但目前尚未見有在體外儲存紅細胞及血小板中作用的相關報道[7-10]。

5 展望 通過對ncRNA功能的闡述，使我們明確非編碼RNA調控血細胞存儲損傷中的重要作用，同時，也揭示了非編碼RNAs很可能成為血細胞儲存期間的重要調節因子。對ncRNAs的功能以及它們之間、它們和mRNA及DNA之間的相互作用的研究，有利于進一步明確ncRNA在血細胞存儲過程中調控機制，提高血細胞體外儲存的質量，延長體外儲存時間，進而改善患者輸血療效。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突