枳實通降顆粒通過干預MK2 磷酸化抑制炎癥反應防治術后炎性腸梗阻相關性肺損傷

莫 黎李 倩 王華帥 李 瑩 黃 麗 何永恒

（1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙410005； 2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208； 3.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙410006）

肺部感染是腹部手術后的常見并發癥之一［1］，直接影響患者的術后康復，甚至危及患者的生命安全［2］。術后炎性腸梗阻（postoperative ileus，POI）是腹部尤其是腸道手術后無法避免的一個特殊時期或并發癥，其持續時間的長短與術后患者肺部感染的發生具有一定的相關性［3?4］。手術創傷等導致的炎癥反應不但是POI 的主要原因，其激發的瀑布式炎癥反應也是造成肺臟損傷的重要原因［5］。因此，有效地防治POI，促進術后胃腸功能的早期恢復對預防術后肺部感染的發生，保障術后患者的順利康復具有重要的臨床意義［6］。

在前期的研究中證實，枳實通降顆粒不但能顯著地促進結直腸腫瘤術后胃腸功能的恢復，有效地預防術后早期炎性腸梗阻的發生，并且對肺部感染的發生也有一定的防治作用［7］。為進一步論證及探明其可能的作用機制，本實驗以POI 模型大鼠為研究對象，觀察枳實通降顆粒對大鼠肺組織的MK2 磷酸化的影響，探討其保護POI 相關性肺損傷的作用及可能機制，以期為該藥的進一步開發和應用提供參考。

1 材料

1.1 動物 鼠齡6 周的SPF 級SD 大鼠84 只，雌雄各半，體質量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK（湘）2016?0002。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心實驗室，實驗動物使用許可證號SYXK（湘）2019?0009，適應性喂養1 周后開始實驗。本實驗已經湖南中醫藥大學實驗動物理論委員會批準（LL2019092005）。

1.2 藥物 專利方枳實通降顆粒［8］由枳實10 g、烏藥10 g、大腹皮10 g、廣木香10 g、黃柏10 g、澤瀉12 g、三七6 g、西洋參6 g、川牛膝12 g、甘草6 g組成。中藥飲片購自湖南中醫藥大學第二附屬醫院門診中藥房（湖南新匯制藥廠生產），并由周平蘭教授鑒定合格，按照傳統法水煎濃縮成生藥含量為3.4 g／mL 的藥液，置于冰箱冷藏備用。琥珀酸普蘆卡必利片（意大利Janssen Cilag S.p.A.公司生產，2 mg×7 片／盒，批號JGL6E00），將其制備成含藥量為0.036 mg／mL 的混懸液。

1.3 試劑 IL?6、IL?8、TNF?α 試劑盒（上海晶天生 物，批號E20200103010、E20200103011、E20200103012）；彩色預染蛋白標志物（美國Thermo 公司，貨號26616）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、化學發光檢測試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0014S、CW0049）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（美國PROTEINTECH 公司，貨號SA00001?1、SA00001?2）；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒（南京建成海浩生物科技有限公司，貨號A044?1?1）。引物［生工生物工程（上海）股份有限公司，221020117］；逆轉錄試劑盒及PCR 試劑盒（美 國Promega 公 司，A3500、A6001）；Trizol（美國Invitrogen 公司，15596018）；Protein G Magnetic Beads（美國Cell Signaling 公司，9006S）；蛋白質標志 物（美國 Thermo 公 司，26634）；HE 染液（珠海貝索生物技術有限公司）。

1.4 儀器 紫外分光光度計（上海現科儀器有限公司）；酶標儀（芬蘭雷勃公司）；全自動化學發光分析儀（上海天能生命科學有限公司）；電泳儀、Real?time PCR 儀（美國BIO?RAD 公司）；灰度分析軟件（美國Alpha Innotech 公司）；液基薄層細胞制片儀（武漢宏翔惠康生物制品有限公司）。

2 方法

2.1 造模與分組 84 只SD 大鼠按照隨機數字表法隨機分為7組：空白組，假手術組，模型組，枳實通降顆粒低、中、高劑量組和普蘆卡必利組，每組各12 只，雌雄各半，分別于術后24 h 取材。所有大鼠于術前禁食24 h，禁水12 h，術后禁食不禁水。根據前期造模實驗選擇最優的造模方法為3%戊巴比妥鈉（3 mL／kg 體質量腹腔注射麻醉大鼠）麻醉大鼠并固定，常規消毒鋪無菌單，逐層開腹，找到盲腸，沿盲腸根部結扎并切除結扎部分盲腸，用兩根鹽水棉簽自空腸起始部開始夾持并輕輕向遠心端摩擦小腸壁，至回盲部為止，只處理1 次，然后回納小腸，分兩層關腹，整個手術過程約15 min左右；假手術組僅分層打開腹腔，然后用鹽水紗布覆蓋，15 min 后分兩層關腹。

2.2 給藥 造模術后6 h，所有大鼠均按5 mL／kg給藥量標準一次性灌胃給藥。根據大鼠體表面積換算確定給藥劑量，枳實通降顆粒低、中、高劑量組分別按照4.2、8.3、16.6 g／kg 的標準給予中藥濃縮藥液，普蘆卡必利組按照0.18 mg／kg 給藥［9］，空白組、假手術組、模型組則給予等量生理鹽水。

2.3 標本采集及指標檢測 術后24 h 再次麻醉后心尖取血處死大鼠，打開腹腔及胸腔采集標本后進行分別檢測。

2.3.1 HE 染色觀察肺組織病理形態學改變 取右肺下葉，固定、包埋、切片，蘇木精伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理形態學改變情況，并采用美國胸科協會肺損傷評分標準［5］進行評分，主要指標為肺泡上皮的損傷程度、炎癥細胞的浸潤、肺泡隔的厚度等，總分數為0～5分。見表1。

表1 肺損傷病理學評分標準Tab.1 Pathology criteria for scoring of lung injury

2.3.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）肺泡中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞數量計算 將大鼠胸腔和頸部打開，顯露氣管及雙側主支氣管，夾閉右主支氣管及近咽喉處遠端氣管，將右肺標本取下。于主支氣管夾閉處近端穿入的5＃頭皮針管，以5 mL 無熱原生理鹽水灌入左肺，保留9 s 后回收，再次注入并重復3 次，匯集3 次的肺泡灌洗液，立即以4 500 r／min 離心10 min，棄上清，用Hank’s 液洗細胞1 次，再離心，棄去上清液，HE 染色后，針對每份標本，在光學顯微鏡下取10個高倍鏡視野統計細胞總數，并進行細胞分類（吞噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞）計數。

2.3.3 ELISA 法檢測肺組織IL?6、IL?8、TNF?α 的水平及MPO 活性 取出右中上肺葉標本，－80 ℃冰箱保存，粉碎、勻漿、離心后取上清液，檢測肺組織中IL?6、IL?8、TNF?α 水平；參照過氧化物酶（MPO）試盒說明書操作檢測MPO 活性，MPO 活力（U／g）＝（測定OD值－對照OD值）／（11.3×參與反應血清量）。

2.3.4 Western blot、RT?PCR 檢測肺組織MK2、p?MK2 蛋白及mRNA 表達 取各組大鼠右下肺葉標本，按照以下步驟進行檢測：提取組織總蛋白，BCA 法測蛋白濃度，SDS?PAGE 電泳，轉膜，依次加入一抗及二抗進行免疫反應，化學發光并用顯影，定影試劑進行顯影和定影，PhotoShop 整理去色，Alpha 軟件處理系統分析目標帶的光密度值。觀察肺組織中MK2 及p?MK2 蛋白表達情況。按照PCR 劑盒說明書操作，提取所得肺組織中總的RNA，進行擴增后檢測并計算MK2、p?MK2 mRNA的表達情況。見表2。

表2 PCR 引物序列Tab.2 PCR primer sequences

2.4 統計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行統計學分析，計量資料以（）表示，如符合正態分布和方差齊性，則采用單因素方差分析進行多組比較，組間比較采用LSD 法分析；如不符合正態分布及方差齊性，則采用Kruskal?Wallis H 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 肺組織病理形態學及評分 模型組肺組織結構破壞明顯，肺間質和肺泡腔中有明顯的中性粒細胞浸潤，肺間隔明顯增寬，偶見少量的蛋白質殘留物組，枳實通降顆粒中、高劑量組大鼠肺組織結構破壞減輕，肺間隔無明顯增寬，肺泡腔和肺間質內中性粒細胞滲出減少。模型組與空白組及假手術組比較，評分升高（P＜0.01）；藥物干預各組與模型組比較，各干預組病理結構改變相對較輕，以枳實通降顆粒高、中劑量為明顯（P＜0.05，P＜0.01），其次為低劑量組及普蘆卡必利組，但無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

表3 各組大鼠肺組織病理學評分比較（， n＝12）Tab.3 Comparison of pulmonary histopathological scores of each group（， n＝12）

表3 各組大鼠肺組織病理學評分比較（， n＝12）Tab.3 Comparison of pulmonary histopathological scores of each group（， n＝12）

注：與空白組及假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與枳實通降顆粒低劑量組比較，☆☆P＜0.01；與普蘆卡必利組比較，△△P＜0.01。

圖1 枳實通降顆粒對大鼠肺組織病理形態學改變的影響（HE， ×100）Fig.1 Effects of Zhishi Tongjiang Granules on pulmonary pathomorphological changes of rats（HE， ×100）

3.2 枳實通降顆粒對模型大鼠肺組織IL?6、IL?8、TNF?α 水平的影響 與假手術組及空白組比較，模型組肺組織中炎性因子水平偏高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物干預組炎性因子水平偏低（P＜0.01），以枳實通降顆粒中、高劑量效果最明顯，優于其他藥物干預組（P＜0.05，P＜0.01），見表4。

表4 各組大鼠肺組織中炎癥因子IL?6、IL?8、TNF?α 水平比較（， n＝12）Tab.4 Comparison of pulmonary inflammatory factors IL?6， IL?8 and TNF?α in rats of each group（， n＝12）

表4 各組大鼠肺組織中炎癥因子IL?6、IL?8、TNF?α 水平比較（， n＝12）Tab.4 Comparison of pulmonary inflammatory factors IL?6， IL?8 and TNF?α in rats of each group（， n＝12）

注：與空白組及假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與枳實通降顆粒低劑量組比較，☆☆P＜0.01；與普蘆卡必利組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.3 枳實通降顆粒對模型大鼠肺泡灌洗液中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞計數的影響 與假手術組及空白組比較，模型組肺泡灌洗液中炎性細胞計數偏高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物干預組炎性細胞計數偏低（P＜0.01），以枳實通降顆粒中、高劑量效果最明顯，優于其他藥物干預組（P＜0.05，P＜0.01），見表5。

表5 各組大鼠肺泡灌洗液中炎性細胞計數比較（， n＝12）Tab.5 Comparison of inflammatory cell counts in BALF of rats in each group（， n＝12）

表5 各組大鼠肺泡灌洗液中炎性細胞計數比較（， n＝12）Tab.5 Comparison of inflammatory cell counts in BALF of rats in each group（， n＝12）

注：與空白組及假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與枳實通降顆粒低劑量組比較，☆☆P＜0.01；與普蘆卡必利組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.4 枳實通降顆粒對各組大鼠肺組織中MK2、p?MK2 蛋白及mRNA 表達情況及MPO 活性的影響 與空白組及假手術組比較，模型組小腸組織p?MK2 蛋白及mRNA 的表達、MPO 活性偏高（P＜0.01）；各藥物干預組p?MK2 蛋白的表達水平、MPO 活性低于模型組（P＜0.01），以枳實通降顆粒中、高劑量組最明顯，與普蘆卡必利組及低劑量組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。各組MK2 蛋白及mRNA 的表達無統計學差異（P＞0.05）。見圖2、表6～7。

表6 各組大鼠肺組織中MK2 及p?MK2 蛋白表達情況及MPO 活性情況比較（， n＝12）Tab.6 Comparison of pulmonary MK2 and p?MK2 protein expression and MPO activity of rats in each group（， n＝12）

表6 各組大鼠肺組織中MK2 及p?MK2 蛋白表達情況及MPO 活性情況比較（， n＝12）Tab.6 Comparison of pulmonary MK2 and p?MK2 protein expression and MPO activity of rats in each group（， n＝12）

注：與空白組及假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與枳實通降顆粒低劑量組比較，☆☆P＜0.01；與普蘆卡必利組比較，△△P＜0.01。

圖2 枳實通降顆粒對各組大鼠肺組織中MK2、p?MK2蛋白表達的影響Fig.2 Effects of Zhishi Tongjiang Granules on the expression of pulmonary MK2 and p?Mk2 protein of rats in each group

4 討論

表7 各組大鼠肺組織中MK2 及p?MK2 mRNA 表達情況比較（， n＝12）Tab.7 Comparison of pulmonary MK2 and p?MK2 mRNA expression of rats in each group（， n＝12）

表7 各組大鼠肺組織中MK2 及p?MK2 mRNA 表達情況比較（， n＝12）Tab.7 Comparison of pulmonary MK2 and p?MK2 mRNA expression of rats in each group（， n＝12）

注：與空白組及假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與枳實通降顆粒低劑量組比較，☆☆P＜0.01；與普蘆卡必利組比較，△△P＜0.01。

《靈樞·本輸》曰：“肺合大腸，大腸者，傳導之府”，五臟之肺與六腑之大腸互為表里，關系密切，是中醫藏象學說的主要理論之一。肺與大腸不但在解剖上緊密聯系，在生理和病理上也很容易相互影響。如《靈樞·四時氣》有云，“腹中常鳴，氣上沖胸，喘不能久立，邪在大腸。”二者在生理上相互依存，病理上相互傳變，治療上相互為用。《黃帝內經靈樞集注》 云，“大腸為肺之腑而主大便，……故大腸之病，亦能上逆而反遺于肺。”臨床上當大腸有病時，往往會影響到肺，導致肺臟出現相應的病變，而腸道手術自然也會影響到肺，這也從中醫理論上闡明了臨床結直腸腫瘤手術后容易并發肺部感染的機理［10］。

研究證實［11?12］，肺與腸道關系密切，不但在組胚生理上具有共源性，病理生理上也相互影響。二者的黏膜上皮細胞均來自胚胎時期的內胚層，且黏膜免疫因子具有同步性，通過淋巴系統歸巢等途徑相互聯系，共同發揮局部特異性免疫功能，是人體的黏膜免疫系統的主要構成部分。腸道有病，腸源性有害因素可經腸道和全身循環淋巴管、血管循環系統到達肺部，導致肺部炎癥反應；同時，腸道功能的障礙，也會影響機體營養的攝入，降低機體免疫力，容易造成術后肺部感染的易發。肺與大腸之間相互影響作用，形成了肺?腸軸聯動學說的主要解剖和病理生理學基礎，這也是結直腸腫瘤手術后肺部感染易發性的病理生理學基礎。而肺泡液中的一些炎癥因子也與肺部感染的發生密切相關，如檢測肺泡灌洗液中IL?6 水平及白細胞分類計數對早期肺炎的臨床診斷就具有重要臨床意義，其敏感性要優于血液降鈣素原檢測［13］。因此，抑制手術造成的炎癥反應，促進胃腸功能恢復對防治腹部大手術后肺部感染具有重要意義。

手術操作誘發的炎癥反應在術后24 h 達到最高峰，48 h 后逐步降低，本實驗也證實術后24 h肺組織中的炎癥因子水平最高。引起POI 相關性炎癥反應的機制復雜，涉及多個信號傳導通路的共同作用［14］。P38 信號通路是炎癥反應中最重要的一條通路，其中關鍵性物質MK2 激酶，參與并調控了炎癥反應的發生、發展過程。MK2 通過磷酸化而得以激活，介導炎癥反應中細胞因子的產生和細胞遷移，調節促炎因子的釋放，產生炎癥反應，進而介導POI 及其相關性肺損傷的重要途徑［15?16］。從實驗中可得知，枳實通降顆粒能有效的抑制MK2 的磷酸化，具有較強的抗炎作用，并且與用藥劑量存在正相關。這可能正是枳實通降顆粒防治POI，進而促進術后胃腸功能的恢復和保護肺組織的作用機制所在。該機制的闡明，將為枳實通降顆粒的進一步的深入研究開發奠定了基礎，也為中藥復方在該領域的應用研究拓展了思路。然而，中藥復方的有效成分復雜，作用靶點多，枳實通降顆粒是否其還能通過其他通路產生作用，以及對肺?腸軸的影響作用機制尚有待進一步研究。