頂空毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定雷公藤多苷片中殘留溶劑

何風(fēng)艷何 軼王 峰王亞丹戴 忠 馬雙成

（中國食品藥品檢定研究院，北京100050）

雷公藤多苷片為雷公藤多苷加輔料制成的片劑，具有抗炎及免疫抑制的作用［1］，臨床廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［2?3］、腎病綜合癥［4?6］、慢性蕁麻疹［7?8］、銀屑病［9?10］等疾病的治療。其主藥雷公藤多苷主含二萜內(nèi)酯、生物堿、三萜等活性成分，是由衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.的去皮根芯木質(zhì)部加水或乙醇、氯仿提取及硅膠柱色譜分離得到的脂溶性成分混合物［11?14］。由于雷公藤多苷制備過程中使用了多種有機(jī)溶劑，為了評(píng)價(jià)制劑質(zhì)量，保證用藥安全，本研究參照《中國藥典》 相關(guān)指導(dǎo)原則［14］，采用頂空毛細(xì)管柱色譜法對(duì)制劑中4種有機(jī)溶劑殘留量進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料

7890B 氣相色譜儀、7697A 頂空進(jìn)樣器、FID 檢測(cè)器（美國Agilent 公司）。N，N?二甲基甲酰胺（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇，環(huán)己烷（色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司）；無水乙醇，氯仿（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。雷公藤多苷片15 批，來自10 家企業(yè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 B?624 毛細(xì)管柱（30 m × 0.32 mm，1.8 μm）；檢測(cè)器FID；柱體積流量1.5 mL／min；柱溫程序升溫，起始溫度40 ℃，保持5 min，再以10 ℃／min 升溫至220 ℃；進(jìn)樣口溫度230 ℃；檢測(cè)器溫度300 ℃；載氣為高純氮；頂空加熱箱90 ℃，平衡時(shí)間30 min；定量環(huán)100 ℃，傳輸線110 ℃。理論塔板數(shù)以氯仿峰計(jì)算不低于10 000。色譜圖見圖1。

圖1 各成分GC圖

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取甲醇、乙醇、氯仿、環(huán)己烷對(duì)照品適量，加N，N?二甲基甲酰胺制成每1 mL分別含2.4、3.4、2.1、2.2 mg 的溶液，作為對(duì)照品貯備液。取對(duì)照品貯備液液適量，加N，N?二甲基甲酰胺稀釋得到每1 mL含甲醇0.001 8 mg、乙醇0.96 mg、氯仿0.14 mg、環(huán)己烷0.023 mg 的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品1.0 g，精密稱定，置10 mL頂空瓶中，精密加入N，N?二甲基甲酰胺3 mL，密封瓶口，渦旋混勻，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品貯備液，加N，N?二甲基甲酰胺逐級(jí)稀釋，得到系列溶液，分別吸取各溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系

2.4 精密度試驗(yàn) 精密移取對(duì)照品溶液3 mL，置10 mL頂空瓶中，在“2.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得甲醇、乙醇、氯仿和環(huán)己烷峰面積RSD分別為2.5%、2.0%、2.2%、2.9%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取雷公藤多苷片（S1）約1.0 g，精密稱定，平行6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，結(jié)果甲醇含量低于線性范圍，乙醇含量為0.24%，RSD分別為1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

取雷公藤多苷片（S15）約1.0 g，精密稱定，平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，結(jié)果乙醇含量低于線性范圍，甲醇、氯仿和環(huán)己烷的含量分別為0.000 33%、0.029%、0.006 0%，RSD分別為4.2%、1.5%、0.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取雷公藤多苷片（S1）約0.5 g，精密稱定，平行6 份，置10 mL 頂空瓶中，精密加入每1 mL 含乙醇0.427 mg／mL 的對(duì)照品溶液3 mL，渦旋混勻，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

取雷公藤多苷片（S15）約0.5 g，精密稱定，平行6份，置10 mL 頂空瓶中，精密加入每1 mL分別含甲醇、氯仿、環(huán)己 烷0.577、0.046、9.11 μg／ mL 的對(duì)照品溶液3 mL，渦旋混勻，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.7 檢測(cè)限及定量限 取對(duì)照品貯備液，加N，N?二甲基甲酰胺逐級(jí)稀釋，精密吸取3 mL 至10 mL 頂空瓶中，測(cè)定信噪比，以信噪比為3 時(shí)的溶液濃度作為檢出限，以信噪比為10 時(shí)的溶液濃度作為定量限，結(jié)果見表1。

2.8 樣品含量測(cè)定 取雷公藤皂苷片15 批，在“2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，結(jié)果見表3。

表3 雷公藤多苷片中殘留溶劑測(cè)定結(jié)果（%）

3 討論

傳統(tǒng)的直接進(jìn)樣法氣化溫度較高，樣品可能在氣化過程中分解，并且色譜分離易受樣品基體干擾。頂空進(jìn)樣法使用較低的平衡溫度，抽取氣液平衡后的氣體成分進(jìn)行色譜分析，可以有效減少基體干擾。實(shí)驗(yàn)曾采用直接進(jìn)樣，殘留溶劑色譜峰受基體影響而峰型較差，采用頂空進(jìn)樣可有效改善峰型，因此實(shí)驗(yàn)中使用頂空進(jìn)樣法。

頂空進(jìn)樣法中，常用溶劑包括水、N，N?二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等。雷公藤多苷為脂溶性混合物，以N，N?二甲基甲酰胺為溶劑，可快速溶解主藥及其殘留溶劑，利于檢測(cè)。同時(shí)，雷公藤多苷制備過程中可能使用的有機(jī)溶劑主要為非高沸點(diǎn)溶劑，N，N?二甲基甲酰胺沸點(diǎn)適宜，可滿足測(cè)定要求。

實(shí)驗(yàn)中比較了不同頂空加熱溫度（70、80、90 ℃）和加熱時(shí)間（20、30、40 min）對(duì)殘留溶劑測(cè)定的影響。結(jié)果表明，隨著加熱溫度升高，溶劑峰面積呈增加的趨勢(shì)，而不同加熱時(shí)間對(duì)測(cè)定影響不大，最終選擇90 ℃下加熱30 min。

隨著藥品安全性保障工作的提升，制劑及藥用輔料中殘留溶劑的檢測(cè)日益受到重視。2020年版《中國藥典》 一部中三七三醇皂苷、三七總皂苷等3個(gè)提取物和心腦健片、正清風(fēng)痛寧片等7個(gè)制劑品種（或主藥原料）已對(duì)殘留溶劑進(jìn)行檢測(cè)。這些品種的生產(chǎn)工藝均涉及有機(jī)溶劑提取或大孔樹脂使用。雷公藤多苷由衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤的去皮根芯木質(zhì)部加水或乙醇、氯仿提取及硅膠柱色譜分離得到［11?14］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷片中存在甲醇、乙醇、氯仿、環(huán)己烷4種有機(jī)溶劑。參考文獻(xiàn)［11，14］，主藥雷公藤多苷提取過程中可能用到乙醇和氯仿；甲醇、氯仿、環(huán)己烷都是硅膠柱色譜純化過程中常用的有機(jī)溶劑。此外，乙醇還是片劑制備中常用的潤濕劑。主藥生產(chǎn)及片劑制備工藝可能引入此4種有機(jī)溶劑。

《中國藥典》 規(guī)定藥品中甲醇、乙醇、氯仿、環(huán)己烷的限度分別為0.3%、0.5%、0.006%和0.388%［15］。對(duì)10個(gè)廠家15 批樣品的測(cè)定結(jié)果表明，B 廠家6 批樣品乙醇含量超出限度（0.63%～0.96%），J 廠家1 批樣品氯仿含量超出限度（0.029%），存在有機(jī)溶劑殘留超標(biāo)情況。2種超標(biāo)溶劑中，氯仿被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2B 類，為疑似致癌物，危害較高［16］，應(yīng)引起重視。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議廠家進(jìn)一步完善生產(chǎn)工藝，其他類似中藥制劑也應(yīng)以此為鑒，加強(qiáng)對(duì)殘留溶劑的監(jiān)控，以避免過量有機(jī)溶劑殘留對(duì)人民用藥安全帶來的不利影響。